Amoebae of medical relevance in reptiles

Reptilien beherbergen verschiedene Amöbenspezies, welche auch als potentielle Pathogene auftreten können. Das Ziel dieser Studie war, gesunde Reptilien eines Tiergartens auf die frei lebenden Amöben (FLA) Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris, Naegleria fowleri sowie die für Reptilien pathogenen, anaeroben Entamoeba invadens zu untersuchen. Im Zuge von sechs Beprobungen wurden Maul- und Kloakenabstriche von 53 asymptomatischen Reptilien (16 Schlangen, 20 Schildkröten und 17 Echsen) und einer erkrankten Schlange (Boa "Ziehharmonika-Krankheit") genommen. Die Auswertung der Proben erfolgte durch Kultivierung und mittels PCR. Im Rahmen dieses Projektes wurde ein Standard-PCR-Protokoll zum Nachweis von Acanthamoeba spp. optimiert, sowie zwei neue PCR-Systeme zum Nachweis von B. mandrillaris und E. invadens etabliert. Insgesamt waren 64,8 % der Reptilien positiv auf Acanthamoeba spp. und 53,7 % auf E. invadens. In der Kultur erwiesen sich 20,3% der Reptilien als Acanthamoeba spp. positiv. Es konnte weder B. mandrillaris noch N. fowleri mittels Kultur oder PCR nachgewiesen werden. Dies stimmt mit den Ergebnissen aus der Literatur überein, da Infektionen mit diesen Organismen in Tieren und Menschen überaus selten sind. Auch im Fall von E. invadens war die Kultur negativ. Die hohe Infektionsrate mit Acanthamoeba spp. war aufgrund der ubiquitären Verbreitung dieser Amöben zu erwarten, im Gegensatz zu der hohen Infektionsrate mit E. invadens, da dieser Organismus bislang vorwiegend in erkrankten Tieren, jedoch nicht in offenbar gesunden Tieren nachgewiesen wurde. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass ein regelmäßiges Screening des Tierbestandes insbesondere in zoologischen Gärten sinnvoll wäre, um das Infektionsrisiko für Tiere, Zooangestellte und Zoobesucher zu minimieren.Reptiles have been reported to harbor several potentially pathogenic amoebae, such as Acanthamoeba spp., B. mandrillaris and N. fowleri - "free-living amoebas" (FLA), which have all been reported to provoke severe brain infections in humans. Anaerobic Entamoeba invadens are known to cause severe and often fatal amoebosis in reptiles. The aim of this study was the screening of asymptomatic reptiles of a zoological collection for the occurrence of these amoebae. In six sample drawings, mouth and cloacal swabs from 53 apparently healthy reptiles (16 snakes, 20 chelonians and 17 lizards) and one diseased snake (Boa accordion disease") were collected. These samples were investigated both by culture and PCR for the occurrence of FLA and E. invadens. For molecular analysis two new PCR protocols for the detection of B. mandrillaris and E. invadens were established and a standard Acanthamoeba PCR protocol was optimized. Our results showed that 64.8% of the investigated reptiles turned out to be Acanthamoeba spp. positive and 53.7% E. invadens positive in PCR. In culture 20.3% of the samples were Acanthamoeba positive. B. mandrillaris and N. fowleri were not detected. The high infection rates with Acanthamoeba spp. can be explained by the high ubiquity of these amoebae. The high infection rates with E. invadens were unexpected, because this organism has predominantly been reported from diseased instead of asymptomatic animals. Our results clearly indicate that a periodical screening of the livestock in zoological collections would be meaningful to minimize the health risk for animals, keepers and visitors

Single nucleotide polymorphisms associated with antibiotic resistance in clinically relevant pathogens

Der weltweite Anstieg von Antibiotika resistenten Bakterien ist ein großes Problem für das öffentliche Gesundheitssystem. Die Resistenztestung humanpathogener Bakterien erfordert eine schnelle und gezielte Charakterisierung für eine optimale Behandlung des Patienten. Clostridium difficile ist weltweit der häufigste Erreger nosocomial erworbener Diarrhoe. Ein vielversprechendes Antibiotikum, vor allem zur Behandlung rezidiver C. difficile Infektionen (CDI) ist Rifaximin. Rifaximin Resistenz in C. difficile wird durch Punkt Mutationen (SNP) im rpoB Gen (kodiert die ß- Untereinheit der RNA Polymerase) und daraus resultierenden Aminosäuren Substitutionen verursacht. Das Ziel dieser Dissertation war die Etablierung einer schnellen, stabilen und kosteneffektiven Methode zum Nachweis von SNPs im rpoB Gen klinischer C. difficile Isolate. Es wurde ein Detektionssystem bestehend aus einer PCR und einer High-resolution melting curve Analyse (HRM) deren Zielsequenz die hot-spot Region des rpoB ist, etabliert. Durch die Sequenzierung eines 325 bp großen DNA Fragments des rpoB Gens von 348 C. difficile Stämmen und konnten 24 Punktmutationen detektiert werden. Somit konnten 16 PCR Sequenz-Typen (PCR-ST) definiert werden. Aufgrund der Größenlimitierung des DNA Fragments in der HRM (152 bp) wurden 15 von 24 SNPs detektiert und infolgedessen 11 HRM Kurven Profile (HRM-CP) definiert. Mit dieser HRM können bis auf Ausnahme von zwei SNPs alle zuvor publizierten Punktmutationen die mit Rifaximin Resistenz assoziiert werden, nachgewiesen werden. Die zweite Studie behandelt die Eignung von Rifaximin für die Durchführung eines Disk-diffusion Test im Vergleich mit einem Broth Mikrodiulution Assay. Die Studie zeigte äquivalente Ergebnisse im Vergleich der beiden Testmethoden. 62 C. difficile Stämme wurden als Rifaximin resistent getestet und die Sequenzierung des rpoB (325 bp) zeigte Punktmutationen in allen untersuchten Stämmen. Das dritte Projekt beschreibt die Etablierung einer real time PCR zur raschen Detektion von SNPs im 16S rRNA Gen, die mit Amikacin, Kanamycin und Capreomycin Resistenzen in extensive drug resistant Mycobacterium tuberculosis assoziiert werden. Zusammenfassend zeigt diese Dissertation, dass PCR basierende Methoden schnelle, stabile und kosteneffektive Nachweismethoden zur Bestimmung von Resistenzen in humanpathogenen Bakterien sind und somit Einfluss auf die Behandlung betroffener Patienten hat.Antibiotic resistance in clinically relevant pathogens is a major public health problem worldwide. Since the numbers of antibiotic resistant bacteria are increasing a fast clarification of the resistance is essential for the treatment of affected patients. Clostridium difficile is the main causative of hospital-acquired diarrhoea worldwide and rifaximin is an antibiotic for the treatment of C. difficile infections (CDI) especially in case of recurring CDI. Reduced rifaximin susceptibility bases on single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the rpoB gene which encodes the b-subunit of the RNA polymerase, the main target of rifaximin. The aim of this thesis was the establishment of a new detection method of SNPs in rpoB of clinical C. difficile isolates. In the main study, the screening of 348 C. difficile samples of different PCR ribotypes by conventional PCR (325 bp amplicon) revealed 16 PCR-sequence types (PCR-ST) characterised by 24 detected SNPs. High-resolution melting curve (HRM) analysis established 11 different HRM-curve profiles (HRM-CP) based on 15 of 24 SNPs located in the rpoB hot-spot region (151 bp amplicon). Beside two SNPs associated with reduced rifaximin susceptibility, all previously published SNPs are detectable by this HRM. In another project on the suitability of rifaximin for disc diffusion test in comparison to rifaximin broth microdilution assay 62 phenotypically reduced rifaximin susceptible C. difficile strains were identified. Sequence analysis of the 325 bp rpoB amplicon revealed the presence of non-synonymous SNPs in these strains corroborating the association of SNPs in rpoB with reduced rifaximin susceptibility. Moreover, this study showed that the rifaximin disc diffusion test is equivalent to the rifaximin broth microdilution assay. ^The third project was dedicated to a RT-PCR for the rapid determination of antibiotic resistance (amikacin, kanamycin and capreomycin) based on SNPs in the 16S rRNA gene in extensive drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains. Altogether, this thesis demonstrates that PCR based methods, especially HRM are fast, reliable and cost-effective techniques to determine antibiotic resistance in clinically relevant pathogens. Moreover, fast antibiotic susceptibility testing methods in routine laboratories may have an impact on the treatment of infected patients.submitted by Verena PecavarAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Med. Univ., Diss., 2013OeB