Bitter taste receptors and gastrointestinal chemosensing in mice

Il sistema digerente è un organo sensorio capace di riconoscere le sostanze presenti nel lume e di iniziare un’ adeguata risposta, che si traduce in digestione ed assorbimento per i nutrienti o eliminazione per le sostanze nocive. E’ stato dimostrato che i recettori per l’amaro (T2R), un’ampia famiglia di GPCR in grado di riconoscere composti amari nella bocca, così come le molecole coinvolte nella trasduzione del segnale, sono espressi a livello della mucosa intestinale. Poiché l’amaro si è evoluto come un meccanismo di allarme nella bocca, proponiamo che i T2R nel sistema gastrointestinale possano servire come un secondo livello di difesa verso composti nocivi. In questo studio abbiamo usato qRT-PCR per stabilire la distribuzione di due sottotipi recettoriali dei T2R (mT2R138 e mT2R108), e della loro subunità Gα-Gustducin (Gust), nel sistema digerente del topo, e varie diete sono state usate per vedere se il contenuto del lume è in grado di modulare i recettori dell’amaro. Per testare l’ipotesi che i T2R nel sistema digerente possano servire come meccanismo di difesa nei confronti di patogeni, in ulteriori studi si è misurato tramite WB il grado di fosforilazione della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK p44/42) per valutare se i T2Rs rispondano ad acil-omoserin-lattoni, molecole prodotte da batteri Gram negativi. La risposta, valutata su cellule STC-1 e NCM-460, è stata confrontata con quella evocata da agonisti per i T2R_feniltiocarbamide (PTC) e denatonio benzoato (DB)_e bloccata dall’antagonista del recettore T2R138, Probenecid. Il meccanismo che segue l’ attivazione dei T2R è stato ulteriormente caratterizzato con l’uso di GF-1, un inibitore della proteina chinasi C, e di nitrendipina, un bloccante dei canali calcio. Questo studio dimostra che mT2R138, mT2R108 e Gust sono espressi lungo tutto il sistema digerente, con diversa abbondanza, e che diverse diete sono in grado di modulare specificamente alcuni recettori, in aree selezionate lungo il sistema digerente. Abbiamo anche dimostrato che sia la linea cellulare umana di colonociti NCM-460, sia la linea di cellule enteroendocrine di topo STC-1 esprimono T2R e rispondono allo stimolo del gusto amaro e ad AHL con una rapida fosforilazione della MAPK p44/42, mostrando un profilo dose-dipendente. Il segnale indotto da PTC e AHL è bloccato dal Probenecid e ridotto dal GF-1, ma non dalla nitrendipina, al contrario del segnale indotto dal DB. Inoltre, l’esposizione delle cellule NCM-460 per 4-24 ore a PTC o AHL induce un aumento significativo dell’espressione del recettore T2R38 umano, omologo del T2R138 nel topo. In conclusione, questo lavoro di tesi propone che i T2R siano coinvolti nell’abilità sensoria del sistema gastrointestinale e che possano esistere diverse funzioni a seconda del sottotipo recettoriale espresso, del sito di espressione e del meccanismo utilizzato. Abbiamo mostrato che diversi tipi di cellule di origine intestinale esprimono diversi sottotipi di T2R e che essi possano usare diversi meccanismi. Inoltre, suggeriamo che i T2R possano interagire con batteri nel sistema gastrointestinale, a supporto dell’ipotesi per cui i recettori dell’amaro costituiscono un secondo livello di difesa nel sistema gastrointestinale, in grado di iniziare una risposta infiammatoria per combattere i batteri patogeni presenti nel lume.The gastrointestinal (GI) tract is a chemosensory organ that detects nutrients in the lumen to initiate an appropriate response of digestion and absorption of nutrients or elimination of harmful substances. It has been shown that bitter taste receptors (T2Rs), a large family of GPCRs detecting bitter compounds in the mouth, and their signaling molecules, are also expressed in the GI tract mucosa. Because bitter taste has evolved as a warning mechanism in the mouth, we hypothesize that T2Rs in the GI tract might serve as a second level of defense towards harmful compounds. In this study, we used qRT-PCR to investigate the distribution of two T2Rs subtypes (mT2R138 and mT2R108), and their signaling molecule Gα-Gustducin (Gust), in the mouse GI tract, and different diets to see whether they are modulated by luminal content. To test the hypothesis that T2Rs in the gut might serve as a mechanism of defense against pathogens, additional studies measured by WB the phosphorylation of mitogen activated protein kinase (MAPK) to evaluate whether T2Rs respond to Acyl Homoserine Lactone (AHL), quorum sensing molecule for Gram negative bacteria. The response on STC-1 and NCM-460 cells was compared to the ones elicited by T2Rs agonists_phenylthiocarbamide (PTC) and denatonuim benzoate (DB)_and blocked by the T2R138 antagonist Probenecid. The pathway following T2Rs activation was further characterized using GF-1, a protein kinase C inhibitor, and nitrendipine, a Ca++ channel blocker. We found that mT2R138, mT2R108 and Gust are expressed throughout the entire mouse GI tract, with different levels of expression, and that different diets selectively modulate T2Rs in specific GI regions. Also, we showed that both NCM-460 human colonocytes and STC-1 mouse enteroendocrine cells express T2Rs and respond to bitter stimuli and AHL with rapid dose-dependent phosphorylation of MAPK p44/42. PTC and AHL-induced signal was blocked by Probenecid and reduced by GF-1, but not by nitrendipine, in contrast with DB-induced MAPK phosphorylation. Furthermore, exposure of NCM-460 cells to PTC or AHL for 4-24 h induced a significant increase in hT2R38 mRNA, the homologus of mT2R138. In summary, these data suggest that T2Rs are involved in chemosensing in the GI tract and that different functions might exist depending upon receptor subtype, site of expression and molecular mechanism. We showed that different T2R subtypes are expressed in different GI cell types and that they might use different pathways. Also, we suggest that T2Rs might detect bacterial stimuli in GI cells, supporting the hypothesis that activation of these receptors might provide a second level of defense in the GI mucosa to initiate an inflammatory process in response to bacteria in the gut lumen

Enteric dysfunctions in experimental Parkinson's disease: alterations of excitatory cholinergic neurotransmission regulating colonic motility in rats

Parkinson's disease (PD) is frequently associated with gastrointestinal symptoms, mostly represented by constipation and defecatory dysfunctions. This study examined the impact of central dopaminergic denervation, induced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle, on distal colonic excitatory cholinergic neuromotor activity in rats. Animals were euthanized 4 and 8 weeks after 6-OHDA injection. In vivo colonic transit was evaluated by radiological assay. Electrically and carbachol-induced cholinergic contractions were recorded in vitro from longitudinal and circular muscle colonic preparations, while acetylcholine levels were assayed in their incubation media. Choline acetyltransferase (ChAT), HuC/D (pan-neuronal marker), muscarinic M2 and M3 receptors. As compared with control rats, at week 4 6-OHDA-treated animals displayed the following changes: decreased in vivo colonic transit rate; impaired electrically evoked neurogenic cholinergic contractions; enhanced carbachol-induced contractions; decreased basal and electrically stimulated acetylcholine release from colonic tissues; decreased ChAT immunopositivity in the neuromuscular layer; unchanged density of HuC/D immunoreactive myenteric neurons; increased expression of colonic muscarinic M2 and M3 receptors. The majority of such alterations were detected also at week 8 post-6-OHDA injection. These findings indicate that central nigrostriatal dopaminergic denervation is associated with an impaired excitatory neurotransmission characterized by a loss of myenteric neuronal ChAT positivity and decrease in acetylcholine release, resulting in a dysregulated smooth muscle motor activity, which likely contributes to the concomitant decrease in colonic transit rate