Speciation and Quantification of Thiols by Reversed-Phase Chromatography Coupled with On-Line Chemical Vapor Generation and Atomic Fluorescence Spectrometric Detection: Method Validation and Preliminary Application for Glutathione Measurements in Human Whole Blood

AbstractBackground: We developed a sensitive, specific method for the low–molecular-mass thiols cysteine, cysteinylglycine, glutathione, and homocysteine and validated the method for measurement of glutathione in blood.Methods: The technique was based on reversed-phase chromatography (RPC) coupled on line with cold vapor generation atomic fluorescence spectrometry (CVGAFS). Thiols were derivatized before introduction on the column by use of a p-hydroxymercuribenzoate (PHMB) mercurial probe and separated as thiol-PHMB complexes on a Vydac C4 column. Postcolumn on-line reaction of derivatized thiols with bromine allowed rapid conversion of the thiol-PHMB complexes to inorganic mercury with recovery of 100 (2)% of the sample. HgII was selectively detected by atomic fluorescence spectrometry in an Ar/H2 miniaturized flame after sodium borohydride reduction to Hg0.Results: The relationship between thiol-PHMB complex concentration and peak area (CVGAFS signal) was linear over the concentration range 0.01–1400 μmol/L (injected). The detection limits were 1, 1, 0.6, and 0.8 nmol/L for cysteine, cysteinylglycine, homocysteine, and glutathione in the injected sample, respectively. The CVs for thiols were 1.5%–2.2% for calibrator solutions and 2.1% and 3.0% for real samples. The RPC-CVGAFS method allowed speciation of glutathione (reduced and oxidized) in human whole blood from healthy donors and from the coronary sinus of patients with idiopathic dilated cardiomyopathy during and after chronotropic stress.Conclusion: The RPC-CVGAFS method could be used to measure reduced and oxidized glutathione in human whole blood as disease biomarkers

Insulin resistance is a major determinant of myocardial blood flow impairment in anginal patients

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Sequencing of NOTCH1, GATA5, TGFBR1 and TGFBR2genes in familial cases of bicuspid aortic valve

BACKGROUND: The purpose of our study was to investigate the potential contribution of germline mutations in NOTCH1, GATA5 and TGFBR1 and TGFBR2 genes in a cohort of Italian patients with familial Bicuspid Aortic Valve (BAV). METHODS: All the coding exons including adjacent intronic as well as 5(′) and 3(′) untranslated (UTR) sequences of NOTCH1, GATA5, TGFBR1 and TGFBR2 genes were screened by direct gene sequencing in 11 index patients (8 males; age = 42 ± 19 years) with familial BAV defined as two or more affected members. RESULTS: Two novel mutations, a missense and a nonsense mutation (Exon 5, p.P284L; Exon 26, p.Y1619X), were found in the NOTCH1 gene in two unrelated families. The mutations segregated with the disease in these families, and they were not found on 200 unrelated chromosomes from ethnically matched controls. No pathogenetic mutation was identified in GATA5, TGFBR1 and TGFBR2 genes. CONCLUSIONS: Two novel NOTCH1 mutations were identified in two Italian families with BAV, highlighting the role of a NOTCH1 signaling pathway in BAV and its aortic complications. These findings are of relevance for genetic counseling and clinical care of families presenting with BAV. Future studies are needed in order to unravel the still largely unknown genetics of BAV

Low High-Density Lipoprotein Cholesterol and Abnormal Glucose Control in Idiopathic Left Ventricular Dysfunction

Aims: To investigate whether cardiovascular (CV) risk factors are associated with myocardial blood flow (MBF) abnormalities and play any prognostic role in patients with idiopathic left ventricular (LV) dysfunction. Methods: We studied 83 patients (61 males, age 60?10 years) with mild-to-severe LV dysfunction (mean ejection fraction 38%, range 19-53%), no history of diabetes and angiographically normal coronary arteries. We measured absolute MBF by positron emission tomography and 13N-ammonia at rest and after dipyridamole. The following CV risk factors were recorded: age, sex, family history of coronary artery disease or dilated cardiomyopathy, newly diagnosed type II diabetes (NIDD), insulin resistance (IR, defined as Homeostasis Model Assessment index >2), hypertension, hypercholesterolemia, low high density lipoprotein (HDL) cholesterol, smoking habit, and obesity. Cardiac death, transplantation, and progressive LV dysfunction were the censored events during followup. Results: Depressed MBF reserve (<2) was present in 48 patients (58%). Using multivariate logistic regression analysis, low HDL cholesterol (P = 0.039) and NIDD or IR (P = 0.012) were the only variables significantly associated with depressed MBF during stress after adjustment for risk factors, LV function and pharmacological treatment. Moreover, low HDL cholesterol (P = 0.039) and female sex (P = 0.021) were significantly associated with depressed MBF reserve. During follow-up (median, 6 years), cardiac events occurred in 18 patients (22%). At Cox regression analysis, depressed MBF reserve (P = 0.034) and LV dilatation (P = 0.047) were the only significant and independent predictors of event-free survival. Conclusion: In idiopathic LV dysfunction, low HDL cholesterol and NIDD/IR are associated with abnormal hyperemic MBF and flow reserve. Risk factors are not determinants of patient outcome, which is predicted by MBF reserve and LV dilatation

MARCATORI BIOUMORALI E GENETICI PER DEFINIRE IL RISCHIO INDIVIDUALE DI CARDIOPATIA ISCHEMICA

Negli ultimi anni la mortalità cardiovascolare in Europa si è progressivamente ridotta sia per le nuove strategie terapeutiche sia per la riduzione di alcuni dei maggiori fattori di rischio cardiovascolare. Tuttavia la mortalità per malattie cardiovascolari continua ad essere la principale causa di morte, nonché di morbilità e di perdita di qualità della vita nei paesi industrializzati. In particolare, la diffusione di nuovi fattori di rischio (inattività fisica, diabete ed obesità) si associa ad una aumentata prevalenza della cardiopatia ischemica (CI), che rimane una delle cause principali di morte cardiaca. Un ulteriore miglioramento della prevenzione ed il trattamento e riconoscimento precoce della CI sono, da un lato strategie necessarie per ridurre mortalità, morbilità e per migliorare la qualità di vita e, dall’altro, costituiscono una sfida per il contenimento dei costi del sistema sanitario. Il gold standard sarebbe quello di identificare nuove strategie non invasive, a basso costo e già pronte per l'utilizzo clinico. Attualmente, la stima del rischio di CI viene effettuata in base alla presentazione clinica ed alla presenza di alcuni riconosciuti fattori di rischio cardiovascolare. Questa stima del rischio efficace su larga popolazione, ha diversi limiti se applicata a popolazioni più specifiche o al singolo individuo in cui fattori genetici interagiscono con fattori acquisiti nel modulare la suscettibilità alla malattia coronarica. Per questo, ad oggi, l'identificazione e la caratterizzazione di un gruppo di biomarcatori in grado di stimare il rischio di CI rimane una sfida aperta. In questo contesto, l’obiettivo principale di questo lavoro di tesi è stato quello di cercare di identificare dei biomarcatori (bioumorali e genetici) che, integrati a dati clinici, potessero consentire una facile stima del rischio individuale di CI. All’interno dello studio “Biohumoral and Genetic Predictors of Cardiac Evolving Phenotype in Ischemic Heart Disease” (Biogen Care-IHD) sono stati arruolati 378 pazienti con sospetta CI, in base alla sintomatologia clinica e/o alla presenza di molteplici fattori di rischio. Per ciascun paziente è stata registrata la storia clinica ed è stato ottenuto un campione di sangue periferico per la determinazione di una serie di biomarcatori circolanti e per l’analisi genotipica di varianti comuni in geni potenzialmente coinvolti nella patogenesi e nella progressione della CI. I pazienti sono stati poi indirizzati a diverse procedure diagnostiche e/o di trattamento sulla base delle loro caratteristiche cliniche a discrezione del medico curante. La descrizione clinica della popolazione, suddivisa in pazienti asintomatici e sintomatici, mostrava che i pazienti asintomatici avevano una maggiore prevalenza di tutti i principali fattori di rischio cardiovascolare (in particolare diabete, 83% vs 23%). L’analisi dei marcatori bioumorali mostrava che la maggiore differenza tra le due sottopopolazioni consisteva in valori elevati di glucosio in pazienti asintomatici e di valori leggermente più elevati di colesterolo LDL, AST, ALP e valori più bassi di FT3 nei pazienti sintomatici. L’analisi genotipica non mostrava differenze significative tra i pazienti asintomatici e sintomatici, fatta eccezione per la variante -75 G>A del gene APOA1 (p 50% in almeno un vaso coronarico epicardico in pazienti che hanno eseguito invasiva angiografia coronarica; 2, ECG da sforzo positivo in pazienti che non eseguono invasiva angiografia coronarica) in grado di descrivere la presenza di malattia ischemica. Tra le variabili cliniche l’eta’ (p=0.01), il sesso maschile (p<0.0001) e la storia familiare per malattia coronarica (p=0.04), si confermavano predittori indipendentidi malattia. Tra le variabili bio-umorali, i bassi livelli di colesterolo HDL (p=0.03), i bassi livelli di adiponectina (p=0.01), e i piu’ alti livelli di Troponina T (p=0.004), risultavano variabili indipendentemente associate con la presenza di malattia ischemica. Tra le varianti genetiche, solo la variante intronica G279A del gene CETP era significativamente associata cone la CI (p=0.04). Nel modello predittivo integrato le variabili indipendentemente associate all’endpoint diagnostico rimanevano: il sesso maschile (p=0.01), il colesterolo HDL (p=0.004), la hsTroponina T (p=0.001) e la variante genetica G279A del gene CETP (p=0.04). Dai risultati di questo studio sono emerse quattro variabili la cui integrazione permette di predire il rischio individuale di malattia ischemica. Queste variabili, se analizzate in una popolazione piu’ ampia, potranno essere utilizzate per la sviluppo di un nuovo metodo di calcolo per il rischio di cardiopatia ischemica facilmente applicabile a tutti i pazienti con sospetta malattia ischemica. Questo permettera’ di avere uno strumento in grado di selezionare in modo appropriato, preciso, accurato e a basso costo i pazienti che dovranno essere indirizzati verso un screening diagnostico avanzato rispetto a quelli che invece dovranno essere sottoposti direttamente ad un trattamento farmacologico e/o rivascolarizzazione

Genetic and Epigenetic Mechanisms Linking Air Pollution and Congenital Heart Disease

Epidemiological studies strongly suggest that parental air pollutants exposure during the periconceptional period may play a major role in causing fetal/newborn malformations, including a frequent heterogeneity in the methods applied and a difficulty in estimating the clear effect of environmental toxicants. Moreover, only some couples exposed to toxicants during the pre-conception period give birth to a child with congenital anomalies. The reasons for such phenomena remain elusive but they can be explained by the individual, innate ability to metabolize these contaminants that eventually defines the ultimate dose of a biological active toxicant. In this paper, we reviewed the major evidence regarding the role of parental air pollutant exposure on congenital heart disease (CHD) risk as well as the modulating effect on detoxification systems. Finally, major epigenetic alterations induced by adverse environment contaminants have been revised as possible mechanisms altering a correct heart morphogenesis