Дослідження активації mTORC1 та його субстракту p70S6K, залучених при цукровому діабеті 2 типу та онкогенетичних процесах

Вступ. Новітні дослідження довели вплив патогенетичних факторів цукрового діабету на активність внутрішньоклітинних сигнальних шляхів регуляції онкогенезу іметаболізму, одним з яких є PI3K/Akt/mTORC1. Макрофаги та лімфоцити беруть участь у патогенезі діабету та раку. Надмірна активація компонентів та субстратів PI3K/Akt/mTORC1 в цих клітинах може вказувати на необхідність додаткової корекції метаболічних процесів у хворих на діабет 2 типу з точки зору профілактики онкологічних захворювань. Мета: вивчити активацію mTORC1 шляхом визначення фосфорилювання PRAS40 та p70S6K1 у лейкоцитах хворих на діабет 2-го типу та рак. Матеріали та методи.Жінки, залучені у дослідженні, були поділені на групи: контрольна група, пацієнти з діабетом 2 типу, хворі на рак та пацієнти з поєднанням раку і діабету. Вміст фосфорильованих PRAS40 (фосфо-T246) та p70S6K1 (фосфо-T389) визначали імуноферментним методом, використовуючи лабораторні набори ELISA КНО0421 таELISA 85-86053 фірми Invitrogen (США). Концентрацію білка в лізаті визначали за допомогою набору для аналізу протеїнів BCA Novagen (США). Вимірювання проводилися намікропланшетному зчитувачі (Bio-tek Instruments, США) при довжині хвилі 450 нм.Результати. Виявлений достовірно підвищений вміст фосфорильованих PRAS40 та p70S6K1 у лейкоцитах хворих на цукровий діабет 2-го типу та рак. Кількість позитивних фосфо-PRAS40 проб у хворих на діабет становила 83,3%, а у хворих на рак -66,7%. Виявлений знижений вміст фосфо-PRAS40 в лейкоцитах пацієнтів з поєднанням діабету і раку. Висновки.Підвищений вміст фосфорильованих PRAS40 та p70S6K1 доводить активацію досліджуваного сигнального шляху при цукровому діабеті 2 типу. Зниження їх активаціїпри поєднанні раку та діабету можна пояснити можливими конкуруючими ефектами білків, які впливають на регулятори цих кіназ або на них безпосередньо.ntroduction.Pathogenetic factors of diabetes may affect the activity of intracellular systems of oncogenesis andmetabolismregulation, one of which is PI3K/Akt/mTORC1. Macrophages and lymphocytes are involved in the pathogenesis of diabetes and cancer. Detection of excessive activation of PI3K/Akt/mTORC1 components and substrates in these cells may indicate the need for additional correction of metabolic processes in patients with type 2 diabetes from the point of prevention of cancer. The aim:to study the activation of mTORC1 by determining the phosphorylation of PRAS40 and p70S6K1 in the leukocytes of patients with type 2 diabetes and cancer.Materials and methods. The study included women from the following groups: control group, patients with type 2 diabetes, cancer patients, patients with both diseases. The content of phosphorylated PRAS40 (phospho-T246) and p70S6K1 (phospho-T389) was determined using laboratory kits ELISA KNO0421 and ELISA 85-86053 of Invitrogen (USA). The protein concentration in the lysate was determined using a BCA Novagen protein assay kit (USA). Measurements were performed on a microplate reader (Bio-tek Instruments, USA) at a wavelength of 450 nm. Results.Significantly increased content of phosphorylated PRAS40 and p70S6K1 inleukocytes of patients with type 2 diabetes mellitus and cancer was detected. The number of positive phospho-PRAS40 tests in patients with diabetes was 83.3%, and in cancer patients -66.7%. Was revealedthe reduced content of phospho-PRAS40 in leukocytesof patients with a combination of diabetes and cancer.Conclusions.The increased amount of phosphorylated PRAS40 and p70S6K1 proves the activation of the studied signaling pathway by diabetes mellitus type 2. Its decrease by cancer and diabetes can be explained by the possible competing effects of the proteins that affect upstream regulators of these kinases or them directly

Association of 5’AMP-activated protein kinase activity with disease duration and HbA1c content in leukocytes in diabetic patients

Background. 5’AMP-activated protein kinase (AMPK) is an enzyme that controls the cell energy ba­lance. With energetic stress in the cell and an increase in the AMP concentration, ATP is replaced by AMP in the exchange centers, resulting in the allosteric activation of AMPK by phosphorylation of 172 threonine within alpha subunit of LKB1 complex in response to changes in cell energy or CAMKKβ, which activates intracellular Ca2+. The purpose was to study the activity of the main energy sensor of cells — AMPK in leukocytes in patients taking insulin preparations, metformin, and other hypoglycemic drugs in association with disease duration and glycated hemoglobin content. Materials and methods. The diabetic patients receiving single-drug or combined therapy with insulin and its analogues, metformin, dapagliflozin and sulfonylureas were randomized into 5 groups: the first group — with an HbA1c level close to the norm — 6.9–7.6 %; the second group — 7.6–9.0 %; the third group — > 9 %; the fourth group > 10 %; the fifth group — > 11 %. To determine the amount of phospho-AMPK (p-Thr172), ELISA kits were used. To get the calibration curve for the AMPK determination, a kidney cell culture HEK293T of the human embryonic kidney was used, which is recommended by manufacturer as a positive control. Results. It was shown that with increase of blood HbA1c, the level of AMPK activity in leukocytes gradually decreased. With increase of blood HbA1c, the level of AMPK activity in leukocytes gradually decreased. The activity of AMPK in leukocytes of patients with HbA1c > 11 % was more than 3.5-fold lower compared to the group with 6.9–7.6 % of HbA1c; AMPK activity in leukocytes in patients with disease duration of 20 years was 3-fold lower. Thus, the AMPK activity in leukocytes may be an indicator of diabetic compensation in diabetic patients. Conclusions. With increase of blood HbA1c, the level of p-AMPK in leukocytes gradually decreased. AMPK activity in leukocytes in diabetes patients with disease duration of 20 years was 3-fold lower than in patients with 10-year experience

Effect of combined treatment with insulin, metformin, and gliclazide on the expression and activity of Akt, mTOR, and p70S6K protein kinases in lymphocytes of diabetic patients

The expression of the main effector protein kinase Akt of the PI3K signaling pathway and the activities of mTOR and p70S6K protein kinases in lymphocytes of patients with diabetes mellitus are determined at the combination treatment with insulin and hypoglycemic drugs. It is shown that the Akt expression is reduced in blood mononuclear cells of patients with diabetes of the 2nd and, to a less extent, type 1. The activities of mTOR and p70S6K are also reduced in lymphocytes of patients with type 2 diabetes. Possible mechanisms of inhibiting the expression and activity of protein kinases are discussed.Визначали експресію основної ефекторної протеїнкінази сигнального шляху PI3K Akt та активність протеїнкіназ mTOR і p70S6K в лімфоцитах хворих на цукровий діабет при комбінованому лікуванні інсуліном і цукрознижувальними препаратами. Показано, що експресія Akt знижена в мононуклеарах крові хворих на діабет 2-го і, меншою мірою, 1-го типу. Активність mTOR і p70S6K також знижена в лімфоцитах хворих на діабет 2-го типу. Обговорюються можливі механізми пригнічення експресії і активності протеїнкіназ.Определяли экспрессию основной эффекторной протеинкиназы сигнального пути PI3K Akt и активность протеинкиназ mTOR и p70S6K в лимфоцитах больных сахарным диабетом при комбинированном лечении инсулином и сахароснижающими препаратами. Показано, что экспрессия Akt снижена в мононуклеарах крови больных диабетом 2-го и, в меньшей степени, 1-го типа. Активность mTOR и p70S6K также снижена в лимфоцитах больных диабетом 2-го типа. Обсуждаются возможные механизмы подавления экспрессии и активности протеинкиназ