Gene Amplification, ABC Transporters and Cytochrome P450s: Unraveling the Molecular Basis of Pyrethroid Resistance in the Dengue Vector, Aedes aegypti

Dengue is the most rapidly spreading arboviral infection of humans and each year there are 50–100 million cases of dengue fever. There is no vaccine or drug to prevent dengue infection so control of the mosquitoes that transmit this virus is the only option to reduce transmission. Removing mosquito habitats close to human homes can be effective but in reality most dengue control programmes rely on a small number of chemical insecticides. Therefore, when the mosquito vectors develop resistance to the available insecticides, dengue control is jeopardized. In this study we examined the causes of resistance to the insecticide class most commonly used in mosquito control, the pyrethroids. We found that a group of genes, which have been implicated in detoxifying these insecticides in other populations of dengue vectors, were highly over expressed in both these Caribbean populations and we investigated the molecular basis of this increased expression. The next steps, which will be a considerable challenge, are to utilize this information to develop effective means of restoring insecticide susceptibility in dengue vectors

Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας του κουνουπιού aedes aegypti στα πυρεθροειδή

Dengue is the most rapidly spreading arboviral infection of humans and each year there are 50–100 million cases of dengue fever. There is no vaccine or drug to prevent dengue infection so control of the mosquitoes that transmit this virus is the only option to reduce transmission. Removing mosquito habitats close to human homes can be effective but in reality most dengue control programs rely on a small number of chemical insecticides. Therefore, when the mosquito vectors develop resistance to the available insecticides, dengue control is jeopardized. In this study we examined the causes of resistance to the insecticide class most commonly used in mosquito control, the pyrethroids. Pyrethroid insecticides are widely utilized in dengue control. However, the major vector, Aedes aegypti, is becoming increasingly resistant to these insecticides and this is impacting on the efficacy of control measures. The near complete transcriptome of two pyrethroid resistant populations from the Caribbean was examined to explore the molecular basis of this resistance. Two previously described target site mutations; 1016I and 1534C were detected in pyrethroid resistant populations from Grand Cayman and Cuba. In addition between two and five per cent of the Ae. aegypti transcriptome was differentially expressed in the resistant populations compared to a laboratory susceptible population. Approximately 20 per cent of the genes over-expressed in resistant mosquitoes were up-regulated in both Caribbean populations (107 genes). Genes with putative monooxygenase activity were significantly over represented in the up-regulated subset, including five CYP9 P450 genes. Quantitative PCR was used to confirm the higher transcript levels of multiple cytochrome P450 genes from the CYP9J family and an ATP binding cassette transporter. Over expression of two genes, CYP9J26 and ABCB4, is due, at least in part, to gene amplification. Another gene group classified as lipid metabolism genes was commonly upregulated in both resistant populations. Overexpression of lipid metabolism genes has been seen in a number of occasions where genomic analysis of insecticide resistant populations has been performed. Yet their roles in insecticide resistant have never been assessed. Seven of these genes two ApoD proteins, a fatty acid synthase, two lysosomal acid lipases sharing 99% sequence identity, a steroid dehydrogenase and their transcriptional regulator SREBP were selected for validation with Real Time PCR. With the exception of SREBP the rest of these genes were indeed highly expressed in both pyrethroid resistant populations compared to a laboratory susceptible strain. Once more gene amplification was found responsible, at least in part, for the elevated levels of LIPA in the resistant populations. Rough dissections on mosquitoes heads and bodies, indicated that expression of the lipid metabolism genes, as well as two of the previously examined P450s (CYP9J26 and CYP9J28), occurred mainly in the insect body. A ubiquitous driver daGAL4 was used to drive expression of ApoD and LIPA and CYP9J26, in Drosophila melanogaster. Flies overexpressing each of these genes separately showed significant levels of resistance. Combination of the metabolizing CYP9J26 with each of the novel genes ApoD and LIPA resulted in an even stronger resistance phenotype, while combination of ApoD and LIPA did not give any higher levels of resistance. This result implies that these genes acting from distinct pathways contribute in an additive manner to the resistance phenotype. Finally targeted expression of these proteins to the main detoxification organs via 6g1(HR) GAL4 is sufficient to confer comparable levels of resistance.Ο δάγκειος πυρετός είναι από τις πιο γρήγορα εξαπλωνόμενες τροπικές νόσους τα τελευταία τριάντα χρόνια. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας καταγράφει 50-100 εκατομμύρια περιστατικά ετησίως. Μέχρι στιγμής δεν υπάρχει κάποιο εμβόλιο ή φάρμακο διαθέσιμο για την πρόληψη ή την θεραπεία της νόσου. Ο πιο αποτελεσματικός τρόπος προστασίας παραμένει ο έλεγχος πληθυσμού των κουνουπιών μέσω της χρήσης ενός μικρού αριθμού χημικών εντομοκτόνων. Τα έντομα έχουν την ικανότητα να αναπτύσσουν ανθεκτικότητα σε όλα σχεδόν τα εντομοκτόνα γεγονός που αποδυναμώνει τις προσπάθειες ελέγχου μέσω της χρήσης εντομοκτόνων και αυξάνει τον κίνδυνο έξαρσης επιδημίας δάγκειου στις περιοχές που τα κουνούπια αναπτύσσουν ανθεκτικότητα. Το σχεδόν πλήρες «μεταγράφωμα» δυο ανθεκτικών πληθυσμών που προέρχονται από την Καραϊβική μας έδωσε την δυνατότητα να εξετάσουμε την μοριακή βάση της ανθεκτικότητας. Οι δυο αυτοί ανθεκτικοί πληθυσμοί, από το Grand Cayman και την Cuba αντιστοίχως εμφάνιζαν δυο σημειακές μεταλλάξεις (V1016I και F1534C) στο κανάλι νατρίου. Επιπρόσθετα ένα ποσοστό 2-5% των γονιδίων ρυθμίζονται διαφορετικά στους ανθεκτικούς σε σύγκριση με τον ευαίσθητο εργαστηριακό πληθυσμό. Μεταξύ των γονιδίων των οποίων η έκφραση διαφοροποιείται από κοινού στους δυο ανθεκτικούς πληθυσμούς, ένα 20% δείχνει αύξηση των επιπέδων έκφραση (107 γονίδια). Η λειτουργική ομάδα γονιδίων που εκπροσωπείται περισσότερο στα από κοινού υπερεκφράζονται γονίδια των δυο ανθεκτικών πληθυσμών είναι οι κυτοχρωμικές οξειδάσες. Επιλέχθηκαν 5 κυτοχρωμικές οξειδάσες της CYP9 οικογένειας και ένας ABC μεταφορέας για επιβεβαίωση με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης δύο εξ αυτών των γονιδίων, της CYP9J26 και του ABC μεταφορέα, οφείλεται τουλάχιστον εν μέρει σε γονιδιακή επέκταση. Μια ακόμη ομάδα γονιδίων ρυθμίζεται διαφορετικά και στους δυο ανθεκτικούς πληθυσμούς. Αυτή η ομάδα ταξινομείται λειτουργικά ως ομάδα μεταβολισμού λιπιδίων και περιλαμβάνει, δυο απολιποπρωτεΐνες D (ApoD), δυο λιπάσες με 99% ομοιότητα σε νουκλεοτιδικη αλληλουχία (LIPA), μια συνθάση λιπαρών οξέων (FAS), μια αφυδρογονάση στεροειδών (StDh) και τον κοινό μεταγραφικό ρυθμιστή τους SREBP. Με εξαίρεση των SREBP τα υπόλοιπα γονίδια όντως υπερεκφράζονται στους ανθεκτικούς πληθυσμούς σε σύγκριση με τον εργαστηριακό ευαίσθητο πληθυσμό, ενώ και εδώ φαίνεται η γονιδιακή επέκταση να είναι υπεύθυνη για τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης ενός εξ’ αυτών , της λιπάσης. Ακολούθησε ένας μικρής λεπτομέρειας χαρακτηρισμός του εντοπισμού της έκφρασης των γονιδίων μεταβολισμού λιπιδίων αλλά και των CYP9J26, CYP9J28 στους ανθεκτικούς πληθυσμούς. Ένας απανταχού εκφραζόμενος driver επιλέχθηκε για την λειτουργική ανάλυση των γονιδίων αυτών στη Drosophila. Έκφραση των ApoD, LIPA και CYP9J26 έκανε τις μύγες 2.5-3 φορές πιο ανθεκτικές παρουσία του πυρεθροειδούς δελταμεθρίνη, ενώ οι ApoD και LIPA συνδυαζόμενες με την CYP9J26 δρουν συνεργατικά για να αυξήσουν ακόμη περισσότερο τα επίπεδα ανθεκτικότητας. Τέλος η στοχευμένη έκφραση των γονιδίων αυτών στα κύρια όργανα αποτοξικοποίησης είναι αρκετή για να προσδώσει υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας και συγκρίσιμα με αυτά που επιτυγχάνονται από την καθολική έκφραση των γονιδίων αυτών στη Drosophil

Accession numbers and putative functions for the 20 genes showing the highest elevation in expression in the CAYMAN vs NO comparison and the 20 genes showing the highest decrease in expression in the same comparison.

<p>Detoxification genes are shown in bold.</p

GO term enrichment analysis.

<p>The analysis was performed on the significantly up-regulated genes found in CAYMAN and CUBA-DELTA compared to NO. The BLAST2GO software was used for the annotation, mapping and enrichment analysis. The figure represents all the significant GO-term categories found significantly enriched compared to the reference set (all transcripts present on the microarray) after a Fisher's exact test and Benjamini and Hochberg multiple testing correction (Pval<0.05). The test set percentage indicates the percentage of up regulated genes belonging to a GO term category compared to all up-regulated genes used in the GO-term analysis while the reference set percentage indicates the percentage of a particular GO-term category compared to all genes with GO-terms on the microarray.</p

Quantitative PCR analysis of selected genes from the microarray experiments.

<p>Relative-fold change in transcript and gene copy number normalised to two ribosomal genes was compared between the resistant CAYMAN (A) and CUBA-DELTA (B) strains against the NEW ORLEANS susceptible strain. Transcript levels are shown by the white columns and gene copy numbers by the grey columns. Error bars represent 95% confidence intervals.</p

Detoxification genes differentially expressed in pyrethroid resistant populations relative to the susceptible NO strain.

<p>Detoxification genes differentially expressed in pyrethroid resistant populations relative to the susceptible NO strain.</p

Unrooted distance neighbour joining tree showing phylogeny of <i>Aedes aegypti</i> CYP9 genes.

<p>Nodes with >70% bootstrap support (500 pseudoreplicates) are indicated. Sequences in blue are up-regulated in both CUBA-DELTA and CAYMAN strains from the current study. Sequences underlined are over expressed in ≥2 populations versus laboratory susceptible strains from previously published studies (see text for further details). Sequences marked with * have proven ability to metabolise pyrethroids (Stevenson et al, submitted).</p

Summary of the genes differentially transcribed between resistant and susceptible strains.

<p>The Venn diagram shows the number of genes found significantly (P value<0.01) over- or under-transcribed (>2 fold in either direction) in one or both resistant strains compared to the susceptible New Orleans strain. Upward arrows indicate over- transcribed in resistant strains, downward represent under-transcribed.</p