Amélioration des qualités fonctionnelles des implants à destinée vasculaire

L'objectif global de ce projet de doctorat est d'améliorer les qualités fonctionnelles des prothèses vasculaires de téflon (PTFE). En ce sens, deux stratégies ont été développées: l'une pour diminuer les risques de thromboses et l'autre pour inhiber l'hyperplasie intimale. Les thromboses se produisent dans les prothèses synthétiques car les matériaux utilisés sont non-hémocompatibles. Puisque le seul tissu hémocompatible connu est l'endothélium, le PTFE a été modifié afin de favoriser l'adhésion et la survie des cellules endothéliales. Le PTFE a d'abord été aminé par plasma d'ammoniac puis des bras d'ancrage ont été greffés sur les amines de la surface. Deux bras différents ont été employés, soit l'anhydride glutarique (GA) et le sulfo-SMPB (SMPB). L'autre extrémité des bras d'ancrage a été utilisée pour greffer la fibronectine (FN), une glycoprotéine d'adhésion présente dans les matrices extracellulaires. Le succès de chaque étape de modification à été vérifié par des analyses XPS. La quantité, l'activité et la conformation de la FN sur chacun des bras d'ancrage ont été étudiées par dosage radioactif, des essais d'adhésion cellulaire, ELISA, AFM et angle de contact. La FN favorise l'adhésion des cellules endothéliales sur le PTFE, particulièrement lorsqu'elle est greffée sur GA. La FN greffée sur GA a une plus grande activité biologique et une conformation plus étendue que celle greffée sur SMPB. L'hyperplasie intimale est un épaississement de la couche interne des artères dû à la migration et la prolifération des cellules musculaires lisses (SMCs) et à leur production de matrice extracellulaire. Cet épaississement entraîne une réduction de la lumière artérielle et du flux sanguin, puis ultimement, l'échec de la prothèse. Pour contrer ce phénomène, le potentiel du mésylate d'imatinib à inhiber spécifiquement les SMCs sans nuire à la croissance des cellules endothéliales a été évalué in vitro. Des essais de prolifération de cellules musculaires et endothéliales en mono et en co-culture ont été faits avec différentes concentrations de mésylate d'imatinib. Il a été démontré que des concentrations de 1.2 à 3.7µM de mésylate d'imatinib inhibent les SMCs et favorisent la prolifération des cellules endothéliales. De plus, l'analyse de l'expression des protéines PARP et caspase 3 clivée par western blot a montrée qu'à ces concentrations, le mésylate d'imatinib n'entraîne pas l'apoptose des cellules.The overall objective of this Ph.D. thesis is to improve the patency of PTFE vascular prostheses. To achieve this goal, two strategies were developed: one aiming to decrease thromboses risks and the other to inhibit intimal hyperplasia. Thromboses happen in synthetic prostheses because they are made of non-haemocompatible materials. Since the only known haemocompatible tissue is the endothelium (monolayer of endothelial cells covering the inner wall of all blood vessels and heart), the PTFE was modified in order to promote adhesion and survival of endothelial cells. PTFE was first functionalized by low pressure ammonia plasma to introduce amino groups and linking arms were grafted onto these functional groups. Two different linkers were used, glutaric anhydride (GA) and sulfo-SMPB (SMPB). The free end of linking arms was used to graft fibronectin (FN), an adhesion protein found in most extracellular matrix. The success of each step of modification was ascertained by XPS analyses. FN quantity, activity and conformation on each linking arm was studied by radiolabeling assays, cellular adhesion assays, ELISA, AFM and contact angle. FN greatly promotes endothelial cell adhesion on PTFE, especially when it is grafted onto GA. It was demonstrated that FN grafted on GA had a better biological activity and a more unfolded conformation than FN grafted on SMPB. Intimal hyperplasia is a thickening of the innermost layer of artery wall due to migration and proliferation of smooth muscle cells and their matrix production. This thickening leads to a decrease in lumen size and blood flow which ultimately cause the prosthesis failure. To counter this phenomenon, the inhibition potential of imatinib mesylate over smooth muscle cells and its harmlessness to endothelial cells were evaluated in vitro. Proliferation assays of muscular and endothelial cells were performed in mono and co-culture with different imatinib mesylate concentrations. It was demonstrated that imatinib mesylate inhibits smooth muscle cells and promotes endothelial cell proliferation in a concentration range of 1.2 to 3.7µM. Furthermore, PARP and cleaved caspase 3 expression analyses by western blotting showed that in this concentration range, imatinib mesylate did not cause cell apoptosis

In vivo remodeling of fibroblast-derived vascular scaffolds implanted for 6 months in rats

There is a clinical need for tissue-engineered small-diameter (<6 mm) vascular grafts since clinical applications are halted by the limited suitability of autologous or synthetic grafts. This study uses the self-assembly approach to produce a fibroblast-derived decellularized vascular scaffold (FDVS) that can be available off-the-shelf. Briefly, extracellular matrix scaffolds were produced using human dermal fibroblasts sheets rolled around a mandrel, maintained in culture to allow for the formation of cohesive and three-dimensional tubular constructs, and decellularized by immersion in deionized water. The FDVSs were implanted as an aortic interpositional graft in six Sprague-Dawley rats for 6 months. Five out of the six implants were still patent 6 months after the surgery. Histological analysis showed the infiltration of cells on both abluminal and luminal sides, and immunofluorescence analysis suggested the formation of neomedia comprised of smooth muscle cells and lined underneath with an endothelium. Furthermore, to verify the feasibility of producing tissue-engineered blood vessels of clinically relevant length and diameter, scaffolds with a 4.6 mm inner diameter and 17 cm in length were fabricated with success and stored for an extended period of time, while maintaining suitable properties following the storage period. This novel demonstration of the potential of the FDVS could accelerate the clinical availability of tissue-engineered blood vessels and warrants further preclinical studies

Human adipose-derived stromal cells for the production of completely autologous self-assembled tissue-engineered vascular substitutes

There is a clinical need for small-diameter vascular substitutes, notably for coronary and peripheral artery bypass procedures since these surgeries are limited by the availability of grafting material. This study reports the characterization of a novel autologous tissue-engineered vascular substitute (TEVS) produced in 10weeks exclusively from human adipose-derived stromal cells (ASC) self-assembly, and its comparison to an established model made from dermal fibroblasts (DF). Briefly, ASC and DF were cultured with ascorbate to form cell sheets subsequently rolled around a mandrel. These TEVS were further cultured as a maturation period before undergoing mechanical testing, histological analyses and endothelialization. No significant differences were measured in burst pressure, suture strength, failure load, elastic modulus and failure strain according to the cell type used to produce the TEVS. Indeed, ASC- and DF-TEVS both displayed burst pressures well above maximal physiological blood pressure. However, ASC-TEVS were 1.40-fold more compliant than DF-TEVS. The structural matrix, comprising collagens type I and III, fibronectin and elastin, was very similar in all TEVS although histological analysis showed a wavier and less dense collagen matrix in ASC-TEVS. This difference in collagen organization could explain their higher compliance. Finally, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) successfully formed a confluent endothelium on ASC and DF cell sheets, as well as inside ASC-TEVS. Our results demonstrated that ASC are an alternative cell source for the production of TEVS displaying good mechanical properties and appropriate endothelialization

A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method

Tissue engineering appears as a promising option to create new heart valve substitutes able to overcome the serious drawbacks encountered with mechanical substitutes or tissue valves. The objective of this article is to present the construction method of a new entirely biological stentless aortic valve using the self-assembly method and also a first assessment of its behavior in a bioreactor when exposed to a pulsatile flow. A thick tissue was created by stacking several fibroblast sheets produced with the self-assembly technique. Different sets of custom-made templates were designed to confer to the thick tissue a three-dimensional (3D) shape similar to that of a native aortic valve. The construction of the valve was divided in two sequential steps. The first step was the installation of the thick tissue in a flat preshaping template followed by a 4-week maturation period. The second step was the actual cylindrical 3D forming of the valve. The microscopic tissue structure was assessed using histological cross sections stained with Masson's Trichrome and Picrosirius Red. The thick tissue remained uniformly populated with cells throughout the construction steps and the dense extracellular matrix presented corrugated fibers of collagen. This first prototype of tissue-engineered heart valve was installed in a bioreactor to assess its capacity to sustain a light pulsatile flow at a frequency of 0.5 Hz. Under the light pulsed flow, it was observed that the leaflets opened and closed according to the flow variations. This study demonstrates that the self-assembly method is a viable option for the construction of complex 3D shapes, such as heart valves, with an entirely biological material

Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes

Tissue engineering provides a promising alternative for small diameter vascular grafts, especially with the self-assembly method. It is crucial that these grafts possess mechanical properties that allow them to withstand physiological flow and pressure without being damaged. Therefore, an accurate assessment of their mechanical properties, especially the burst pressure, is essential prior to clinical release. In this study, the burst pressure of selfassembled tissue-engineered vascular substitutes was first measured by the direct method, which consists in pressurizing the construct with fluid until tissue failure. It was then compared to the burst pressure estimated by Laplace's law using data from a ring tensile test. The major advantage of this last method is that it requires a significantly smaller tissue sample. However, it has been reported as overestimating the burst pressure compared to a direct measurement. In the present report, it was found that an accurate estimation of the burst pressure may be obtained from a ring tensile test when failure internal diameter is used as the diameter parameter in Laplace's law. Overestimation occurs with the method previously reported, i.e. when the unloaded internal diameter is used for calculations. The estimation of other mechanical properties was also investigated. It was demonstrated that data from a ring tensile test provide an accurate estimate of the failure strain and the stiffness of the constructs when compared to measurements with the direct method

Mechanical properties of endothelialized fibroblast-derived vascular scaffolds stimulated in a bioreactor

There is an ongoing clinical need for tissue-engineered small-diameter (<6 mm) vascular grafts since clinical applications are restricted by the limited availability of autologous living grafts or the lack of suitability of synthetic grafts. The present study uses our self-assembly approach to produce a fibroblast-derived decellularized vascular scaffold that can then be available off-the-shelf. Briefly, scaffolds were produced using human dermal fibroblasts sheets rolled around a mandrel, maintained in culture to allow for the formation of cohesive and three-dimensional tubular constructs, and then decellularized by immersion in deionized water. Constructs were then endothelialized and perfused for 1 week in an appropriate bioreactor. Mechanical testing results showed that the decellularization process did not influence the resistance of the tissue and an increase in ultimate tensile strength was observed following the perfusion of the construct in the bioreactor. These fibroblast-derived vascular scaffolds could be stored and later used to deliver readily implantable grafts within 4 weeks including an autologous endothelial cell isolation and seeding process. This technology could greatly accelerate the clinical availability of tissue-engineered blood vessels

L’Hôtel-Dieu à Marseille (6 place Daviel et rue des Belles-Ecuelles)Rapport de fouilles archéologiques préventives

L’Hôtel-Dieu se situe sur la rive nord du Vieux-Port, sur les pentes sud-est de la butte des Moulins. L’hôpital du Saint-Esprit, fondé au XIIe s. et reconstruit à plusieurs reprises, a cédé la place à l’Hôtel-Dieu, dans sa configuration actuelle, au XVIIIe s., les plus vieux bâtiments étant définitivement démolis à la fin du XIXe s., avec la création des jardins.En deux endroits, la fouille a livré, à la base de la stratigraphie, des faciès alluviaux torrentiels, liés à l’existence d’un large cône de déjection, composé de paléochenaux à comblements graveleux et sableux. L’absence de matières organiques n’a pas permis de dater ces séquences, mais elles s’accordent bien avec un contexte morpho-climatique ancien, probablement antérieur au post-glaciaire (Tardiglaciaire). Les premiers niveaux anthropisés conservés se rapportent au milieu du Ve s. av. n. è., mais fouillés sur une trop petite surface pour pouvoir être restitués dans leur environnement.La période hellénistique est marquée par le comblement d’une tranchée d’axe est-ouest, qui pourrait témoigner du démantèlement d’une importante canalisation.Dans le dernier quart du Ier s. av. n. è., est édifié un vaste bâtiment, partiellement dégagé sur une longueur de 25 m et une largeur de près de 15 m. Les murs sont construits en blocs de grand appareil de calcaire de la Couronne. Cinq espaces ont été reconnus, dont quatre sont dotés d’un sol similaire : de grosses tesselles irrégulières de calcaire blanc et noir et de grès rouge et jaune, noyés dans un terrazzo. Ces sols sont plus ou moins soignés, selon les espaces, et la pièce « centrale » est pourvue d’une bande périphérique blanche. L’espace oriental est doté d’un système de chauffage sur hypocauste, dans son premier état, remplacé ensuite par un canal de chauffe, qui ne débouche plus sous l’espace et ne semble alors devoir chauffer que lemur nord de la pièce. Le plan incomplet de ce bâtiment et le peu de mobilier qui en est issu ne permettent pas de préciser sa fonction exacte. Cependant, sa position prééminente, surplombant le grand complexe thermal du port et l’une des principales voies de la ville antique, ainsi que le luxe de sa décoration, tout à fait inhabituel à Marseille, incite à le considérer comme un bâtiment public, éventuellement un édifice de réunion d’associations professionnelles ou religieuses, collegium ou schola.La période antique tardive n’a laissé que peu de traces sur le site, dont la réoccupation n’est attestée qu’au début du XIIe s. Un premier bâtiment voit alors le jour, construit en pierre et en pisé ; il sera remodelé dans le courant du XIIe s. et abandonné à la fin de ce même siècle.La reconstruction des bâtiments de l’hôpital du Saint‑Esprit et, notamment, de l’église au début du XVIIe s. est assez bien détaillée par les différentes sources archivistiques. Il en ressort une construction étalée sur plusieurs décennies, en raison de difficultés liées au financement. Le choeur est édifié en premier, à compter de 1602, pour que le culte puisse y être rendu et permettre la démolition de l’ancienne église. Puis, les trois travées sont successivement bâties, les différents rajouts étant clairement lisibles à travers les changements d’appareil. Le plan de cette église a été entièrement dégagé lors de la fouille. L’édifice, long de 27 m et large de 11 m hors oeuvre, est divisé en trois travées et comportait latéralement deux chapelles accolées au vaisseau. Sous le choeur et la première travée, une crypte permet de rattraper la topographie accidentée, en réutilisant les sols antiques remis au jour.Cette église sera dérasée en 1864, lors des travaux de réaménagement de l’Hôtel-Dieu.Outre des occupations antiques et médiévales très denses au plus proche du port, la réhabilitation de l’ancien Hôtel-Dieu de Marseille a permis de découvrir les vestiges de l’atelier d’un fondeur d’alliages à base de cuivre sur la colline du Panier, en bordure d’une rue, dernier marqueur d’îlots anciens, annexés tardivement par l’Hôtel-Dieu. Si les sources écrites confirment la présence d’une fonderie dite vieille en 1561 et 1614, dans la rue, l’emplacement et la production ne sont pas précisés. Aucun sol d’atelier n’est conservé. Seules, quelques structures arasées témoignent de l’activité métallurgique. Il s’agit de la partie la plus profonde d’un four de fusion et d’une grande fosse creusée en escalier, dont la fonction, comme fosse de coulée, c’est-à-dire d’un lieu où l’on enterre les moules avant de couler le métal à l’intérieur, peut être proposée. Le four se présente comme une fosse rectangulaire aux parois verticales, avec un escalier au nord pour descendre vers la partie construite au sud. L’étude des artefacts permet d’interpréter cette structure comme le cendrier d’un four à réverbère nettement plus grand. Le comblement de la fosse de coulée a livré de très nombreux morceaux de moules en terre. La fragmentation rend difficile l’interprétation, même si l’on peut entrevoir une production diversifiée. Certains moules de forme cylindrique évoquent des pièces d’artillerie de différentes dimensions, qui pourraient être destinées à la marine. La proximité du port et les besoins en accastillage, notamment en laiton, cet alliage de cuivre et de zinc résistant bien à la corrosion en mer, expliqueraient ce débouché