Aspartilendopeptidasas de Silybum marianum (L) Gaertn con potencial aplicación en la industria láctea

El objetivo general de este trabajo fue aislar, purificar y caracterizar peptidasas aspárticas presentes en flores de Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae) y estudiar su potencial aplicación como “cuajo vegetal”. A partir de este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Obtener preparaciones enzimáticas crudas de flores de Silybum marianum (L.) Gaertn. y caracterizar los extractivos obtenidos. 2. Purificar parcialmente los extractos crudos y caracterizar las preparaciones parcialmente purificadas. 3. Determinar la actividad coagulante de leche bovina de las preparaciones parcialmente purificadas. 4. Obtener hidrolizados parciales de proteínas de leche bovina, caprina y ovina y realizar el análisis electroforético de los mismos. 5. Purificar la enzima de interés a partir de los extractivos de Silybum marianum (L.) Gaertn. y caracterizar la enzima purificada.Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la colaboración del Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM).Facultad de Ciencias Exacta

Diseño de péptidos antifúngicos a partir de dos defensinas de flores de cardo : síntesis y actividad contra fusarium graminearum

Las defensinas vegetales son péptidos básicos ricos en cisteína de 45 a 54 aminoácidos y estructura conservada. A pesar de su similitud estructural presentan diversidad de secuencias, lo cual puede dar cuenta de las diferentes funciones atribuidas (actividad antibacteriana, antifúngica, etc). Se han identificado dos regiones muy conservadas entre las defensinas vegetales, las cuales son importantes en relación con la actividad que exhiben: el -core ubicado en la región C-terminal y el α-core localizado en la región N-terminal. En este trabajo se diseñaron péptidos potecialmente antifúngicos a partir de estas regiones, a través del uso de herramientas bioinformáticas y empleando como plantilla la secuencia de dos defensinas de Silybum marianum (L.) Gaertn. previamente clonadas (DefSm1D y DefSm2). Cinco péptidos fueron sintetizados, purificados y caracterizados: tres derivados de DefSm1D, llamados 3243, 3245 y 3246; y dos a partir de la secuencia de DefSm2, denominados 3248 y 3250. Se evaluó su actividad contra el hongo fitopatógeno Fusarium graminearum Schwabe y dos de ellos, 3248 y 3250, resultaron activos en concentraciones micromolares. El presente trabajo contribuye al conocimiento de las defensinas, las cuales son proteínas de defensa ricas en cisteína presentes en la especie en estudio, que crece en forma silvestre en Argentina y que naturalmente presenta una significativa resistencia a patógenos fúngicosFil: Fernandez, Agustina. Universidad Nacional de La PlataFil: Malbrán, Ismael. Universidad Nacional de La PlataFil: Vairo Cavalli, Sandra Elizabeth. Universidad Nacional de La Plat

Diseño de péptidos antifúngicos a partir de dos defensinas de flores de cardo : Síntesis y actividad contra Fusarium graminearum

Las defensinas vegetales son péptidos básicos ricos en cisteína de 45 a 54 aminoácidos y estructura conservada. A pesar de su similitud estructural presentan diversidad de secuencias, lo cual puede dar cuenta de las diferentes funciones atribuidas (actividad antibacteriana, antifúngica, etc). Se han identificado dos regiones muy conservadas entre las defensinas vegetales, las cuales son importantes en relación con la actividad que exhiben: el gamma-core ubicado en la región C-terminal y el alpha-core localizado en la región N-terminal. En este trabajo se diseñaron péptidos potecialmente antifúngicos a partir de estas regiones, a través del uso de herramientas bioinformáticas y empleando como plantilla la secuencia de dos defensinas de Silybum marianum. previamente clonadas (DefSm1D y DefSm2). Cinco péptidos fueron sintetizados, purificados y caracterizados: tres derivados de DefSm1D, llamados 3243, 3245 y 3246; y dos a partir de la secuencia de DefSm2, denominados 3248 y 3250. Se evaluó su actividad contra el hongo fitopatógeno Fusarium graminearum y dos de ellos, 3248 y 3250, resultaron activos en concentraciones micromolares. Se ensayó también la capacidad de los péptidos de permeabilizar la membrana de conidios de F. graminearum evaluando la captación de ioduro de propidio (IP) a través de microscopía de fluorescencia. Los conidios tratados tanto con 3248 como con 3250 produjeron la permeabilización de las membranas de los conidios. El presente trabajo contribuye al conocimiento de las defensinas, las cuales son proteínas de defensa ricas en cisteína presentes en la especie en estudio, que crece en forma silvestre en Argentina y que naturalmente presenta una significativa resistencia a patógenos fúngicos.Universidad Nacional de La Plat

Diseño de péptidos antifúngicos a partir de dos defensinas de flores de cardo : Síntesis y actividad contra Fusarium graminearum

Las defensinas vegetales son péptidos básicos ricos en cisteína de 45 a 54 aminoácidos y estructura conservada. A pesar de su similitud estructural presentan diversidad de secuencias, lo cual puede dar cuenta de las diferentes funciones atribuidas (actividad antibacteriana, antifúngica, etc). Se han identificado dos regiones muy conservadas entre las defensinas vegetales, las cuales son importantes en relación con la actividad que exhiben: el gamma-core ubicado en la región C-terminal y el alpha-core localizado en la región N-terminal. En este trabajo se diseñaron péptidos potecialmente antifúngicos a partir de estas regiones, a través del uso de herramientas bioinformáticas y empleando como plantilla la secuencia de dos defensinas de Silybum marianum. previamente clonadas (DefSm1D y DefSm2). Cinco péptidos fueron sintetizados, purificados y caracterizados: tres derivados de DefSm1D, llamados 3243, 3245 y 3246; y dos a partir de la secuencia de DefSm2, denominados 3248 y 3250. Se evaluó su actividad contra el hongo fitopatógeno Fusarium graminearum y dos de ellos, 3248 y 3250, resultaron activos en concentraciones micromolares. Se ensayó también la capacidad de los péptidos de permeabilizar la membrana de conidios de F. graminearum evaluando la captación de ioduro de propidio (IP) a través de microscopía de fluorescencia. Los conidios tratados tanto con 3248 como con 3250 produjeron la permeabilización de las membranas de los conidios. El presente trabajo contribuye al conocimiento de las defensinas, las cuales son proteínas de defensa ricas en cisteína presentes en la especie en estudio, que crece en forma silvestre en Argentina y que naturalmente presenta una significativa resistencia a patógenos fúngicos.Universidad Nacional de La Plat

Aspartic peptidases from flowers of Asteraceae with potential biotechnological application

En las últimas décadas el interés por las peptidasas se ha incrementado significativamente. La gran mayoría de las enzimas comerciales que se emplean se obtienen principalmente de microorganismos. Sin embargo, también pueden ser extraídas de especies vegetales que se presentan como una fuente promisoria de estas moléculas. De hecho, las peptidasas vegetales son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria, farmacéutica, biotecnológica y de detergentes, y son candidatas atractivas para el desarrollo de nuevos fármacos y en terapias combinadas. Están ampliamente distribuidas en los organismos vivos. Típicamente presentan un prodominio autoinhibitorio, que debe ser eliminado para activar la enzima. Si bien todas llevan a cabo la misma reacción que consiste en la hidrólisis de los enlaces peptídicos de las proteínas, difieren sin embargo, en la especificidad de sustrato, pH óptimo, la temperatura y otros parámetros que hacen que sus propiedades sean únicas, mostrando una gran diversidad funcional. Dentro de estas moléculas, las peptidasas aspárticas (PAs), constituyen una de las principales clases de peptidasas. Las flores de cardo (familia Asteraceae) son una fuente rica de PAs. Con el fin de asegurar una fuente continua de dichas enzimas, las mismas pueden ser obtenidas de su fuente natural o por métodos recombinantes. Debido a sus propiedades características se emplean en diversos procesos industriales. Ejemplos de aplicaciones tradicionales de estas peptidasas como fabricación de queso así como otras aplicaciones promisorias como la obtención de péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana y citotóxica, acción en la remodelación de la matriz extracelular, inmovilización en esponjas de quitosano, catalizadores en medios orgánicos son discutidas en esta revisión.The interest in peptidase has increased significantly in recent decades. The vast majority of commercial enzymes used in industry are mainly obtained from microorganisms. However, they can also be extracted from plant species that are considered as a promising source of these molecules. In fact, plant peptidases are widely used in the food, detergent, pharmaceutical and biotechnological industry, and are attractive candidates for the development of new drugs and in combination therapies. They are widely distributed in living organisms. Typically they have a self-inhibitory prodomain, which must be removed to activate the enzyme. While all peptidases carried out the same reaction, the hydrolysis of protein peptide bonds, they differ in substrate specificity, optimum pH and temperature as well as in other parameters that make their properties unique, showing a great functional diversity. Among these molecules, aspartic peptidases (APs) are one of the major classes of proteolytic enzymes. Thistle flowers (family Asteraceae) are a rich source of APs. In order to ensure a continuous supply of Aps from flowers, they can be obtained from its natural source or by recombinant methods. Because of their distinctive properties Aps from thistle flowers are used in various industrial processes. Cheese-making is an example of traditional use of thistle APs, but also other promising applications such as production of bioactive peptides with antimicrobial and cytotoxic activity, remodelling of bone extracellular matrix, immobilization in chitosan sponges for drug delivery, and catalysis in organic media are discussed in this review.Facultad de Ciencias Exacta

Aspartic peptidases from flowers of Asteraceae with potential biotechnological application

En las últimas décadas el interés por las peptidasas se ha incrementado significativamente. La gran mayoría de las enzimas comerciales que se emplean se obtienen principalmente de microorganismos. Sin embargo, también pueden ser extraídas de especies vegetales que se presentan como una fuente promisoria de estas moléculas. De hecho, las peptidasas vegetales son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria, farmacéutica, biotecnológica y de detergentes, y son candidatas atractivas para el desarrollo de nuevos fármacos y en terapias combinadas. Están ampliamente distribuidas en los organismos vivos. Típicamente presentan un prodominio autoinhibitorio, que debe ser eliminado para activar la enzima. Si bien todas llevan a cabo la misma reacción que consiste en la hidrólisis de los enlaces peptídicos de las proteínas, difieren sin embargo, en la especificidad de sustrato, pH óptimo, la temperatura y otros parámetros que hacen que sus propiedades sean únicas, mostrando una gran diversidad funcional. Dentro de estas moléculas, las peptidasas aspárticas (PAs), constituyen una de las principales clases de peptidasas. Las flores de cardo (familia Asteraceae) son una fuente rica de PAs. Con el fin de asegurar una fuente continua de dichas enzimas, las mismas pueden ser obtenidas de su fuente natural o por métodos recombinantes. Debido a sus propiedades características se emplean en diversos procesos industriales. Ejemplos de aplicaciones tradicionales de estas peptidasas como fabricación de queso así como otras aplicaciones promisorias como la obtención de péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana y citotóxica, acción en la remodelación de la matriz extracelular, inmovilización en esponjas de quitosano, catalizadores en medios orgánicos son discutidas en esta revisión.The interest in peptidase has increased significantly in recent decades. The vast majority of commercial enzymes used in industry are mainly obtained from microorganisms. However, they can also be extracted from plant species that are considered as a promising source of these molecules. In fact, plant peptidases are widely used in the food, detergent, pharmaceutical and biotechnological industry, and are attractive candidates for the development of new drugs and in combination therapies. They are widely distributed in living organisms. Typically they have a self-inhibitory prodomain, which must be removed to activate the enzyme. While all peptidases carried out the same reaction, the hydrolysis of protein peptide bonds, they differ in substrate specificity, optimum pH and temperature as well as in other parameters that make their properties unique, showing a great functional diversity. Among these molecules, aspartic peptidases (APs) are one of the major classes of proteolytic enzymes. Thistle flowers (family Asteraceae) are a rich source of APs. In order to ensure a continuous supply of Aps from flowers, they can be obtained from its natural source or by recombinant methods. Because of their distinctive properties Aps from thistle flowers are used in various industrial processes. Cheese-making is an example of traditional use of thistle APs, but also other promising applications such as production of bioactive peptides with antimicrobial and cytotoxic activity, remodelling of bone extracellular matrix, immobilization in chitosan sponges for drug delivery, and catalysis in organic media are discussed in this review.Facultad de Ciencias Exacta

Partial Molecular Characterization of Arctium minus Aspartylendopeptidase and Preparation of Bioactive Peptides by Whey Protein Hydrolysis

In this article, we report the cloning of an aspartic protease (AP) from flowers of Arctium minus (Hill) Bernh. (Asteraceae) along with the use of depigmented aqueous flower extracts, as a source of APs, for the hydrolysis of whey proteins. The isolated cDNA encoded a protein product with 509 amino acids called arctiumisin, with the characteristic primary structure organization of typical plant APs. Bovine whey protein hydrolysates, obtained employing the enzyme extracts of A. minus flowers, displayed inhibitory angiotensin-converting enzyme (ACE) and antioxidant activities. Hydrolysates after 3 and 5 h of reaction (degree of hydrolysis 2.4 and 5.6, respectively) and the associated peptide fraction with molecular weight below 3 kDa were analyzed by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis, matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry, and reverse phase-high-performance liquid chromatography. The results obtained in this study demonstrate the viability of using proteases from A. minus to increase the antioxidant and inhibitory ACE capacity of whey proteins.Facultad de Ciencias Exacta

Partial Molecular Characterization of Arctium minus Aspartylendopeptidase and Preparation of Bioactive Peptides by Whey Protein Hydrolysis

In this article, we report the cloning of an aspartic protease (AP) from flowers of Arctium minus (Hill) Bernh. (Asteraceae) along with the use of depigmented aqueous flower extracts, as a source of APs, for the hydrolysis of whey proteins. The isolated cDNA encoded a protein product with 509 amino acids called arctiumisin, with the characteristic primary structure organization of typical plant APs. Bovine whey protein hydrolysates, obtained employing the enzyme extracts of A. minus flowers, displayed inhibitory angiotensin-converting enzyme (ACE) and antioxidant activities. Hydrolysates after 3 and 5 h of reaction (degree of hydrolysis 2.4 and 5.6, respectively) and the associated peptide fraction with molecular weight below 3 kDa were analyzed by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis, matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry, and reverse phase-high-performance liquid chromatography. The results obtained in this study demonstrate the viability of using proteases from A. minus to increase the antioxidant and inhibitory ACE capacity of whey proteins.Facultad de Ciencias Exacta

Callus culture for biomass production of milk thistle as a potential source of milk clotting peptidases

The objective of this work was the optimization of the conditions of in vitro culture for callus production of Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae). Sections of cotyledons, previously disinfected by washing successively with ethanol 70º, NaClO (10% w/v) and Tween 20 (0.05% v/v) and rinsing with sterile distilled water, were used as explants. For its initial culture, B5 medium supplemented with BA and 2,4-D solidified with phytagel was used, and a 63% survival was achieved. To obtain callus, two solid media were assayed (S1 and S2) using B5 medium supplemented with growth regulators (BA and 2,4-D or NAA and BA, respectively). The calli were grown at 25ºC during 45 days in darkness. Growth kinetics was studied using S1 medium obtaining a typical growth curve with an exponential phase after 14 days of incubation (rate of growth 0.005 g dry weight/ day) and stationary phase after 35 days. The rate of growth in S2 medium was slower, and rhizogenesis was observed starting on the fifth week of incubation. From these results, the best culture medium for callus production of Silybum marianum was S1 medium.Facultad de Ciencias Exacta

Callus culture for biomass production of milk thistle as a potential source of milk clotting peptidases

The objective of this work was the optimization of the conditions of in vitro culture for callus production of Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae). Sections of cotyledons, previously disinfected by washing successively with ethanol 70º, NaClO (10% w/v) and Tween 20 (0.05% v/v) and rinsing with sterile distilled water, were used as explants. For its initial culture, B5 medium supplemented with BA and 2,4-D solidified with phytagel was used, and a 63% survival was achieved. To obtain callus, two solid media were assayed (S1 and S2) using B5 medium supplemented with growth regulators (BA and 2,4-D or NAA and BA, respectively). The calli were grown at 25ºC during 45 days in darkness. Growth kinetics was studied using S1 medium obtaining a typical growth curve with an exponential phase after 14 days of incubation (rate of growth 0.005 g dry weight/ day) and stationary phase after 35 days. The rate of growth in S2 medium was slower, and rhizogenesis was observed starting on the fifth week of incubation. From these results, the best culture medium for callus production of Silybum marianum was S1 medium.Facultad de Ciencias Exacta