Aspartilendopeptidasas de Silybum marianum (L) Gaertn con potencial aplicación en la industria láctea

El objetivo general de este trabajo fue aislar, purificar y caracterizar peptidasas aspárticas presentes en flores de Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae) y estudiar su potencial aplicación como “cuajo vegetal”. A partir de este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Obtener preparaciones enzimáticas crudas de flores de Silybum marianum (L.) Gaertn. y caracterizar los extractivos obtenidos. 2. Purificar parcialmente los extractos crudos y caracterizar las preparaciones parcialmente purificadas. 3. Determinar la actividad coagulante de leche bovina de las preparaciones parcialmente purificadas. 4. Obtener hidrolizados parciales de proteínas de leche bovina, caprina y ovina y realizar el análisis electroforético de los mismos. 5. Purificar la enzima de interés a partir de los extractivos de Silybum marianum (L.) Gaertn. y caracterizar la enzima purificada.Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la colaboración del Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM).Facultad de Ciencias Exacta

Diseño de péptidos antifúngicos a partir de dos defensinas de flores de cardo : síntesis y actividad contra fusarium graminearum

Las defensinas vegetales son péptidos básicos ricos en cisteína de 45 a 54 aminoácidos y estructura conservada. A pesar de su similitud estructural presentan diversidad de secuencias, lo cual puede dar cuenta de las diferentes funciones atribuidas (actividad antibacteriana, antifúngica, etc). Se han identificado dos regiones muy conservadas entre las defensinas vegetales, las cuales son importantes en relación con la actividad que exhiben: el -core ubicado en la región C-terminal y el α-core localizado en la región N-terminal. En este trabajo se diseñaron péptidos potecialmente antifúngicos a partir de estas regiones, a través del uso de herramientas bioinformáticas y empleando como plantilla la secuencia de dos defensinas de Silybum marianum (L.) Gaertn. previamente clonadas (DefSm1D y DefSm2). Cinco péptidos fueron sintetizados, purificados y caracterizados: tres derivados de DefSm1D, llamados 3243, 3245 y 3246; y dos a partir de la secuencia de DefSm2, denominados 3248 y 3250. Se evaluó su actividad contra el hongo fitopatógeno Fusarium graminearum Schwabe y dos de ellos, 3248 y 3250, resultaron activos en concentraciones micromolares. El presente trabajo contribuye al conocimiento de las defensinas, las cuales son proteínas de defensa ricas en cisteína presentes en la especie en estudio, que crece en forma silvestre en Argentina y que naturalmente presenta una significativa resistencia a patógenos fúngicosFil: Fernandez, Agustina. Universidad Nacional de La PlataFil: Malbrán, Ismael. Universidad Nacional de La PlataFil: Vairo Cavalli, Sandra Elizabeth. Universidad Nacional de La Plat

Diseño de péptidos antifúngicos a partir de dos defensinas de flores de cardo : Síntesis y actividad contra Fusarium graminearum

Las defensinas vegetales son péptidos básicos ricos en cisteína de 45 a 54 aminoácidos y estructura conservada. A pesar de su similitud estructural presentan diversidad de secuencias, lo cual puede dar cuenta de las diferentes funciones atribuidas (actividad antibacteriana, antifúngica, etc). Se han identificado dos regiones muy conservadas entre las defensinas vegetales, las cuales son importantes en relación con la actividad que exhiben: el gamma-core ubicado en la región C-terminal y el alpha-core localizado en la región N-terminal. En este trabajo se diseñaron péptidos potecialmente antifúngicos a partir de estas regiones, a través del uso de herramientas bioinformáticas y empleando como plantilla la secuencia de dos defensinas de Silybum marianum. previamente clonadas (DefSm1D y DefSm2). Cinco péptidos fueron sintetizados, purificados y caracterizados: tres derivados de DefSm1D, llamados 3243, 3245 y 3246; y dos a partir de la secuencia de DefSm2, denominados 3248 y 3250. Se evaluó su actividad contra el hongo fitopatógeno Fusarium graminearum y dos de ellos, 3248 y 3250, resultaron activos en concentraciones micromolares. Se ensayó también la capacidad de los péptidos de permeabilizar la membrana de conidios de F. graminearum evaluando la captación de ioduro de propidio (IP) a través de microscopía de fluorescencia. Los conidios tratados tanto con 3248 como con 3250 produjeron la permeabilización de las membranas de los conidios. El presente trabajo contribuye al conocimiento de las defensinas, las cuales son proteínas de defensa ricas en cisteína presentes en la especie en estudio, que crece en forma silvestre en Argentina y que naturalmente presenta una significativa resistencia a patógenos fúngicos.Universidad Nacional de La Plat

Aspartic peptidases from flowers of Asteraceae with potential biotechnological application

En las últimas décadas el interés por las peptidasas se ha incrementado significativamente. La gran mayoría de las enzimas comerciales que se emplean se obtienen principalmente de microorganismos. Sin embargo, también pueden ser extraídas de especies vegetales que se presentan como una fuente promisoria de estas moléculas. De hecho, las peptidasas vegetales son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria, farmacéutica, biotecnológica y de detergentes, y son candidatas atractivas para el desarrollo de nuevos fármacos y en terapias combinadas. Están ampliamente distribuidas en los organismos vivos. Típicamente presentan un prodominio autoinhibitorio, que debe ser eliminado para activar la enzima. Si bien todas llevan a cabo la misma reacción que consiste en la hidrólisis de los enlaces peptídicos de las proteínas, difieren sin embargo, en la especificidad de sustrato, pH óptimo, la temperatura y otros parámetros que hacen que sus propiedades sean únicas, mostrando una gran diversidad funcional. Dentro de estas moléculas, las peptidasas aspárticas (PAs), constituyen una de las principales clases de peptidasas. Las flores de cardo (familia Asteraceae) son una fuente rica de PAs. Con el fin de asegurar una fuente continua de dichas enzimas, las mismas pueden ser obtenidas de su fuente natural o por métodos recombinantes. Debido a sus propiedades características se emplean en diversos procesos industriales. Ejemplos de aplicaciones tradicionales de estas peptidasas como fabricación de queso así como otras aplicaciones promisorias como la obtención de péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana y citotóxica, acción en la remodelación de la matriz extracelular, inmovilización en esponjas de quitosano, catalizadores en medios orgánicos son discutidas en esta revisión.The interest in peptidase has increased significantly in recent decades. The vast majority of commercial enzymes used in industry are mainly obtained from microorganisms. However, they can also be extracted from plant species that are considered as a promising source of these molecules. In fact, plant peptidases are widely used in the food, detergent, pharmaceutical and biotechnological industry, and are attractive candidates for the development of new drugs and in combination therapies. They are widely distributed in living organisms. Typically they have a self-inhibitory prodomain, which must be removed to activate the enzyme. While all peptidases carried out the same reaction, the hydrolysis of protein peptide bonds, they differ in substrate specificity, optimum pH and temperature as well as in other parameters that make their properties unique, showing a great functional diversity. Among these molecules, aspartic peptidases (APs) are one of the major classes of proteolytic enzymes. Thistle flowers (family Asteraceae) are a rich source of APs. In order to ensure a continuous supply of Aps from flowers, they can be obtained from its natural source or by recombinant methods. Because of their distinctive properties Aps from thistle flowers are used in various industrial processes. Cheese-making is an example of traditional use of thistle APs, but also other promising applications such as production of bioactive peptides with antimicrobial and cytotoxic activity, remodelling of bone extracellular matrix, immobilization in chitosan sponges for drug delivery, and catalysis in organic media are discussed in this review.Facultad de Ciencias Exacta

Partial Molecular Characterization of Arctium minus Aspartylendopeptidase and Preparation of Bioactive Peptides by Whey Protein Hydrolysis

In this article, we report the cloning of an aspartic protease (AP) from flowers of Arctium minus (Hill) Bernh. (Asteraceae) along with the use of depigmented aqueous flower extracts, as a source of APs, for the hydrolysis of whey proteins. The isolated cDNA encoded a protein product with 509 amino acids called arctiumisin, with the characteristic primary structure organization of typical plant APs. Bovine whey protein hydrolysates, obtained employing the enzyme extracts of A. minus flowers, displayed inhibitory angiotensin-converting enzyme (ACE) and antioxidant activities. Hydrolysates after 3 and 5 h of reaction (degree of hydrolysis 2.4 and 5.6, respectively) and the associated peptide fraction with molecular weight below 3 kDa were analyzed by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis, matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry, and reverse phase-high-performance liquid chromatography. The results obtained in this study demonstrate the viability of using proteases from A. minus to increase the antioxidant and inhibitory ACE capacity of whey proteins.Facultad de Ciencias Exacta

Callus culture for biomass production of milk thistle as a potential source of milk clotting peptidases

The objective of this work was the optimization of the conditions of in vitro culture for callus production of Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae). Sections of cotyledons, previously disinfected by washing successively with ethanol 70º, NaClO (10% w/v) and Tween 20 (0.05% v/v) and rinsing with sterile distilled water, were used as explants. For its initial culture, B5 medium supplemented with BA and 2,4-D solidified with phytagel was used, and a 63% survival was achieved. To obtain callus, two solid media were assayed (S1 and S2) using B5 medium supplemented with growth regulators (BA and 2,4-D or NAA and BA, respectively). The calli were grown at 25ºC during 45 days in darkness. Growth kinetics was studied using S1 medium obtaining a typical growth curve with an exponential phase after 14 days of incubation (rate of growth 0.005 g dry weight/ day) and stationary phase after 35 days. The rate of growth in S2 medium was slower, and rhizogenesis was observed starting on the fifth week of incubation. From these results, the best culture medium for callus production of Silybum marianum was S1 medium.Facultad de Ciencias Exacta

Callus culture for biomass production of milk thistle as a potential source of milk clotting peptidases

The objective of this work was the optimization of the conditions of in vitro culture for callus production of Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae). Sections of cotyledons, previously disinfected by washing successively with ethanol 70º, NaClO (10% w/v) and Tween 20 (0.05% v/v) and rinsing with sterile distilled water, were used as explants. For its initial culture, B5 medium supplemented with BA and 2,4-D solidified with phytagel was used, and a 63% survival was achieved. To obtain callus, two solid media were assayed (S1 and S2) using B5 medium supplemented with growth regulators (BA and 2,4-D or NAA and BA, respectively). The calli were grown at 25ºC during 45 days in darkness. Growth kinetics was studied using S1 medium obtaining a typical growth curve with an exponential phase after 14 days of incubation (rate of growth 0.005 g dry weight/ day) and stationary phase after 35 days. The rate of growth in S2 medium was slower, and rhizogenesis was observed starting on the fifth week of incubation. From these results, the best culture medium for callus production of Silybum marianum was S1 medium.Facultad de Ciencias Exacta

Action of Silybum marianum (L.) Gaertn Peptidases on bovine caseins

Las caseinas (CN) constituyen el 80% de las proteinas totales de la leche, siendo alfas1, alfas2, beta y kappa las cuatro fracciones mayoritarias. La función principal de las CN es nutritiva y los peptidos derivados de las mismas tienen interesantes aplicaciones como suplementos dietarios y en preparaciones farmaceuticas. Las CN totales fueron obtenidas a partir de leche bovina comercial por precipitacion isoeletrica y purificadas mediante cromatografia de intercambio anionico (FPLC) utilizando DEAE-Sepharose FF a pH 7,0. Las fracciones alfa y beta CN purificadas fueron hidrolizadas empleando aspartilendopeptidasas de flores de Silybum marianum y con cuajo bovino comercial. Tanto las CN como los peptidos obtenidos fueron analizados por electroforesis SDS Tricina PAGE y densitograma. Los perfiles hidroliticos mostraron una actividad diferencial y especifica con la preparacion enzimatica de S. marianum, sin proteolisis excesiva. En base a estos resultados, esta preparacion enzimatica podria ser empleada para la obtencion de nutraceuticos o como sustituto de rennet comercial.Bovine milk contains four main types of casein (CN), αs1, αs2, β, and κ, constituting 80% of total protein milk. The main function of CN is nutritious and peptides derived from them have interesting applications as dietary supplements and pharmaceutical preparations. In the present work whole CN were obtaining from commercial bovine milk by isoelectric precipitation and were subsequently purified by anion exchange chromatography (FPLC) with DEAE Sepharose FF media, pH 7.0. α and β CN fractions purified were hydrolysed with aspartylendopeptidases from flowers of Silybum marianum and with commercial rennet. Both the CN as the peptides obtained were analyzed by electrophoresis (Tricine SDS PAGE) and densitograms. Hydrolytic profiles showed a differential and specific activity for the S. marianum enzymatic preparation without excessive proteolysis. Based on these results the enzymatic preparation could be advantageously for obtaining nutraceuticals or as a substitute for commercial rennet.Fil: Rusconi, Maria Elina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; ArgentinaFil: Priolo, Nora Silvia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; ArgentinaFil: Lopez, Laura Maria Isabel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; ArgentinaFil: Vairo Cavalli, Sandra Elizabeth. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentin

Artichoke cv. Francés flower extract as a rennet substitute: effect on textural, microstructural, microbiological, antioxidant properties, and sensory acceptance of miniature cheeses

BACKGROUND: The most common milk-clotting enzymes in the cheese industry are recombinant chymosins. Food naturalness is a factor underpinning consumers' food choice. For consumers who avoid food with ingredients from genetically modified organisms (GMOs), the use of vegetable-based rennet substitute in the cheese formulation may be a suitable solution. Artichokes that deviate from optimal products, when allowed to bloom due to flower protease composition, are excellent as raw material for vegetable rennet preparation. As enzymatic milk clotting exerts a significant impact on the characteristics of the final product, this product should be studied carefully. RESULTS: Mature flowers from unharvested artichokes (Cynara scolymus cv. Francés) that did not meet aesthetic standards for commercialization were collected and used to prepare a flower extract. This extract, as a coagulant preparation, enabled the manufacture of cheeses with distinctive characteristics compared with cheeses prepared with chymosin. Rennet substitution did not affect the actual yield but led to significant changes in dry matter yield, humidity, water activity, protein content, and color, and conferred antioxidant activity to the cheeses. The rennet substitution promoted significant modifications in springiness, and in the microstructure of the cheese, with a more porous protein matrix and an increment in the size of the fat globules. Both formulations showed a similar microbiota evolution pattern with excellent microbiological quality and good sensory acceptance. CONCLUSIONS: The rennet substitute studied here produced a cheese adapted to specific market segments that demand more natural and healthier products made with a commitment to the environment but well accepted by a general cheese consumer.Fil: Colombo, Maria Laura. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Cimino, Cecilia Verónica. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; ArgentinaFil: Bruno, Mariela Anahí. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Hugo, Ayelen Amelia. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; ArgentinaFil: Liggieri, Constanza. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; Argentina. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas; ArgentinaFil: Fernández, Agustina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Vairo Cavalli, Sandra Elizabeth. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentin