Reglament del Departament de Biologia Cel·lular, de Fisiologia i d'Immunologia

Acord del Consell de Govern de 8 de juliol de 2004 i modificat per acord de 10 de desembre de 201

Influencia de la citoquina Interleuquina 6 (IL-6) adipocitaria y muscular en el control del metabolismo

La interleuquina -6 (IL-6) es una citoquina pleiotrópica cuya función principal se da en el sistema inmune en el control de la inflamación. Realiza importantes funciones en la homeostasis del sistema nervioso central (SNC), en la respuesta al ejercicio físico e incluso en el metabolismo (particularmente en funciones relacionadas con la insulina). Diversos estudios han demostrado que la IL-6 podría tener un papel en el control del peso corporal tanto a nivel de SNC como periférico, aunque no está claro si la IL-6 endógena que participa en la regulación del peso corporal a nivel del SNC procede del mismo SNC o bien de la periferia. La IL-6 secretada por tejidos periféricos no inmunológicos podría tener un papel importante y esto es actualmente motivo de debate. En la última década se ha puesto de relevancia la capacidad del músculo esquelético de secretar mioquinas. La IL-6 es la principal mioquina producida y liberada durante la contracción muscular por lo que se ha postulado que podría ser un factor que media los efectos del ejercicio a nivel metabólico. El tejido adiposo también la produce y secreta siendo la principal fuente de IL-6 en situaciones no inflamatorias. Dado el importante papel que juegan el músculo esquelético y el tejido adiposo en el control del metabolismo y que ambos son los principales órganos secretores de IL-6 en situaciones no inflamatorias, decidimos estudiar el papel de de la IL-6 producida por estos tejidos en el metabolismo y en el control del peso corporal. Para ello desarrollamos dos modelos de knock-out condicionales para la IL-6: uno en el músculo esquelético y el otro en el tejido adiposo. Estos animales se han caracterizado en condiciones basales y en respuesta a una dieta en grasas. Se hizo el seguimiento del peso y de la ingesta, se estudió la respuesta a la glucosa y a la insulina y se analizó el peso de diferentes tejidos, los niveles varios metabolitos y hormonas y la expresión de algunos genes implicados en el metabolismo y en la inflamación. Los datos obtenidos muestran que la deficiencia de IL-6 tanto muscular como adipocitaria tiene efectos dependientes del sexo. No se observaron alteraciones en el crecimiento en ninguno de los modelos pero sí diferencias en la ganancia de peso. Los machos deficientes en IL-6 muscular engordaron menos que sus controles y en el caso de las hembras se observó lo contrario. Estas diferencias se exacerbaron en los animales alimentados con la dieta grasa. Por lo que respecta a la deficiencia de IL-6 adipocitaria los efectos en la ganancia de peso sólo se vieron en los ratones alimentados con dieta grasa en donde la deficiencia de IL-6 sólo mostró efecto significativo en las hembras que ganaron menos peso que las controles. El estudio de la ingesta y de los neuropéptidos hipotalámicos que controlan la ingesta y el gasto energético sugiere que los efectos de la IL-6 se darían sobretodo en el control del gasto energético y no tanto por cambios en la ingesta. Así, en condiciones basales los machos deficientes en IL-6 muscular presentaron un perfil de activación del gasto energético y en las hembras lo contrario. Por lo que se refiere a la deficiencia de IL-6 adipocitaria, aunque no hubo diferencias en el peso, sí las hubo en los neuropéptidos hipotalámicos. En resumen, la IL-6 tiene efectos en el control de la homeostasis energética a nivel central y periférico. La disminución de los niveles plasmáticos de IL-6, según su origen, tiene diferentes efectos a nivel local regulando la expresión de otro u otros factores que probablemente sea o sean los responsables de los efectos observados.Interleukine 6 is a pleiotropic cytokine whose main function is regulating inflammation in the immune system. However, IL-6 also affects the central nervous system (CNS), and it participates in the exercise response and in metabolism (mainly insulin-related functions). Several studies show that IL-6 could have a role in the control of body weight in both the CNS and the periphery. It is unknown, and currently the matter of debate, whether CNS-acting IL-6 is produced in situ or elsewhere. It would then be possible that IL-6 produced by non-immunologic tissues had an important role in the control of body weight. In the last few decades, it has been shown that skeletal muscle produces and secretes myokines. IL-6 is the most abundant and it is produced during muscular contraction, possibly participating in some of the exercise-induced metabolic changes. Adipose tissue also produces and secretes this cytokine and it is the main source of IL-6 in non-inflammatory conditions. Skeletal muscle and adipose tissue play an important role in metabolism. These tissues are also the main source of IL-6 in non-inflammatory conditions. That is why we decided to investigate the metabolic role of IL-6 produced by these tissues and its actions in the control of body weight. We generated two different IL-6 conditional knock-outs: one in the skeletal muscle and the other in the adipose tissue. These animals were characterized in basal conditions and after being fed a high fat diet. Body weight and food intake were measured. Glucose and insulin response were studied. Several tissues were weighted. Some metabolites and hormones levels and metabolic and inflammatory gene expression were also analyzed. In both models IL-6 deficiency had a sex-dependent effect. Our data suggest that these mice had a normal growth. However, there were changes in body weight gain. Muscular IL-6 deficient mice gained less weight than controls, whereas in females the opposite occurred. These differences were exacerbated in mice fed a high fat diet. Regarding the adipose IL-6 deficiency model, adipose IL-6 deficiency only had an effect in body weight in mice fed a high fat diet. Thus, knockout females showed resistance to obesity, gaining less weight than controls. In males this effect was smaller and not significant. Food intake and hypothalamic neuropeptides controlling food intake and energy expenditure were analyzed, too. Our data suggest that body weight changes would be mainly caused by changes in energy expenditure rather than by changes in food intake. Thus, in basal conditions muscular IL-6 deficient males showed energy expenditure activation and in females the opposite occurred. In the case of adipose IL-6 deficiency, although body weight gain in basal conditions was unchanged, hypothalamic neuropeptide expression was altered. In conclusion, IL-6 has either central or peripheral effects on the control of energy homeostasis. Decreased levels of IL-6 have, depending on their origin, different local effects in the regulation of other factors that probably caused the observed changes

Influencia del Inmuno-estimulador G1M! en la dieta de las doradas juveniles

Tradicionalment, els peixos marins s'han alimentat amb dietes altes en lípids amb ingredients d'origen marí, que contenen els àcids grassos essencials per a aquestes espècies. El subministrament dels olis i les farines de peix s'han vist afectats per l'augment de la ramaderia intensiva incloent l'aqüicultura i els fenòmens naturals que afecten la producció del mar. En diversos estudis s'ha observat que les dietes poden afectar la salut dels peixos cultivats. La quantitat i qualitat dels macronutrients, així com les vitamines i minerals essencials, poden afectar tant la incidència com la gravetat de determinades malalties infeccioses dels peixos. Alguns canvis en les dietes, encara que siguin molt subtils, poden influir greument en la capacitat de l'organisme de resistir els patògens oportunistes. Aquestes malalties microbianes causen grans pèrdues a l'aqüicultura intensiva i necessiten ser controlades per millorar el benestar dels animals i el benefici econòmic. Hi ha diferents tipus de substàncies conegudes per actuar com a immunoestimulants, però només unes poques són aptes per a la seva utilització en l'aqüicultura. Aquests immunoestimulants són extractes biològics i substàncies químiques sintètiques que estimulen la resposta immune mitjançant la promoció de la funció de cèl·lules fagocítiques

Sensibilización de la respuesta emocional y neuroendocrina al estrés : contribución de las características de los estímulos estresantes y mecanismos implicados /

En animales de laboratorio, la exposición previa a estímulos estresantes de naturaleza emocional suele inducir una reducción de algunas respuestas de estrés cuando los animales son re-expuestos al mismo estímulo, mientras que generalmente da lugar a respuestas normales o acentuadas (sensibilización cruzada) frente a un estímulo estresante diferente (heterotípico). En las últimas décadas ha habido un creciente interés por los procesos de sensibilización ya que se postula que están en gran medida implicados en la aparición de un número considerable de alteraciones fisiológicas y psicopatologías, incluyendo desordenes gastrointestinales, dolor crónico, trastorno por estrés post-traumático (PTSD), psicosis o adicción, entre otras. La presente tesis se ha centrado en el estudio de las características de los estímulos estresantes que contribuyen a la inducción y la expresión de la sensibilización cruzada inducida por una única exposición al estrés, así como la exploración de posibles mecanismos implicados en el proceso. Para ello, hemos utilizado ratas macho adultas como sujetos experimentales y se ha valorado la actividad del eje hipotalámico-hipofisario-adrenal (HPA) y aspectos conductuales relacionados con actividad/exploración y ansiedad. Nuestros resultados muestran que una sola exposición a un estímulo estresante de elevada intensidad (inmovilización en planchas, IMO) induce una sensibilización de la respuesta del eje HPA a ambientes nuevos y un incremento en la ansiedad, evaluada mediante el laberinto elevado en cruz (EPM), que son observables durante la semana posterior a la IMO pero no a los diez días. No obstante, la sobreimposición de una sesión breve de choques eléctricos (FS) justo antes del EPM incrementa notablemente la ansiedad en los animales previamente expuestos a una IMO diez días antes, sin afectar a los animales sin experiencia previa con la IMO. Estos datos indican que una sola IMO causa un estado de sensibilización endocrina y conductual a nuevas situaciones de estrés, siendo el efecto más duradero a nivel conductual. Ni la inhibición de la síntesis de glucocorticoides, ni la administración de antagonistas de los receptores de glucocorticoides o del receptor CRHR1 antes de la IMO afectaron a los efectos de la IMO sobre la conducta o a la sensibilización del eje HPA en respuesta a un ambiente nuevo al día siguiente, sugiriendo que ni los glucocorticoides ni los CRHR1 juegan un papel relevante. La comparación de la exposición a la IMO con la exposición a otros estímulos que difieren en intensidad (choques eléctricos y natación forzada), pone de manifiesto que la sensibilización del eje HPA en respuesta a un ambiente nuevo es directamente proporcional a la intensidad del estímulo inductor. Aunque una breve exposición a la IMO es suficiente para inducir sensibilización cruzada del eje HPA, el grado de sensibilización es mayor y más duradero cuanto más prolongada es la exposición a la IMO. Finalmente, demostramos que la sensibilización cruzada del eje HPA tras una exposición previa a la IMO es más evidente cuando el estímulo estresante heterotípico es de menos intensidad, aunque es mucho más crítica la duración de la exposición al estímulo heterotípico, de tal manera que ésta es máxima con 5 min de exposición para desaparecer tras una exposición de 30 min. En conjunto, los datos experimentales presentados en esta tesis, apoyados por el artículo de revisión, permiten delimitar las características de la sensibilización cruzada del eje HPA inducida por la exposición aguda a distintas situaciones de estrés y su relación con la sensibilización conductual. La importancia de la intensidad y duración de los estímulos estresantes tanto respecto a la inducción como a la expresión de la sensibilización aportan luz sobre muchas de las discrepancias que aparecen en la literatura.In laboratory animals, prior exposure to emotional stressors usually induces a reduction of some stress responses when animals are re-exposed to the same stimulus, while exposure to a different stressor (heterotypic) generally results in normal or enhanced responses (cross-sensitization). In the last decades, a growing interest for the processes of sensitization has been generated because it is postulated they are heavily involved in the development of a large number of physiological alterations and psychopathologies, including gastrointestinal disorders, chronic pain, post-traumatic stress disorder (PTSD), psychosis and addiction, among others. This thesis has focused on the study of the characteristics of the stressors that contribute to the induction and expression of cross-sensitization induced by a single prior exposure to stress, as well as on the exploration of mechanisms likely to be involved in this process. To this end, we have used adult male rats as experimental subjects, and the activity of hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA) and some behavioral aspects related to activity/exploration and anxiety have been assessed. Our results show that a single exposure to a severe stressor (immobilization on boards, IMO) induces cross-sensitization of the HPA response to novel environments and increased anxiety, as assessed by the elevated plus maze (EPM). These effects are noted during the week following IMO but not ten days after. However, a brief exposure to foot-shocks just before the EPM markedly enhances anxiety in rats previously exposed to IMO, without altering behavior in animals having no previous experience with IMO. These data indicate that a single IMO causes a state of endocrine and behavioral sensitization to new stressors, being the latter longer-lasting. Neither glucocorticoid synthesis inhibition nor administrations of antagonists for glucocorticoid or CRHR1 receptors before IMO were able to alter behavioral consequences of IMO or HPA cross-sensitization after exposure to the open field (OF) the day after. These data suggest that neither glucocorticoids nor CRHR1 play an important role in these cross-sensitization processes. Comparing IMO with other stressors that differ in intensity (foot-shock or forced swim), indicates cross-sensitization after response to the OF is directly proportional to the intensity of the triggering (inductive) stressor. Although brief exposure to IMO is enough to induce HPA cross-sensitization, the degree of cross-sensitization is greater and longer-lasting after more prolonged exposure to IMO. Finally, we demonstrate that HPA cross-sensitization after a previous exposure to IMO is more evident when the heterotypic stressor is of low intensity. Nevertheless, the length of exposure to the heterotypic stressor is much more critical, so that HPA cross-sensitization is highest with 5 min exposure and disappears after 30 min exposure. Overall, the experimental data presented in this thesis, supported by the review article, allows defining the characteristics of HPA cross-sensitization induced by an acute exposure to different emotional stressors and its relationship with the behavioral sensitization. The relevance of the intensity of stressors and length of exposure regarding both the induction and the expression of cross-sensitization can explain many of the discrepancies observed in the literature

Susceptibilidad o resistencia de la glándula mamaria al desarrollo del cáncer : influencia y mecanismos de acción de la exposición puberal y/o en edad adulta a dietas ricas en aceite de oliva virgen extra y de maíz /

El cáncer de mama es el más frecuente en las mujeres de todo el mundo. Existen evidencias epidemiológicas y, sobretodo, experimentales de que los factores ambientales, especialmente los nutricionales, tienen un papel en la etiología y desarrollo de esta enfermedad. Por otra parte, se ha descrito el adelantamiento de la pubertad como factor de riesgo de cáncer de mama, así como que el momento en que se produce la menarquia viene determinado, en gran parte, por el estado nutricional del individuo. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar los efectos moduladores de las dietas hiperlipídicas de aceite de maíz (M20), rica en PUFA n-6, y de aceite de oliva virgen extra (mO20), rica en MUFA n-9 y compuestos bioactivos, administradas desde la etapa prepuberal o la edad adulta, sobre la maduración sexual y la carcinogénesis mamaria experimental, así como algunos de los mecanismos moleculares por los cuales se podrían ejercer dichos efectos. Se ha utilizado como soporte experimental el modelo de tumores mamarios inducidos en ratas hembra Sprague-Dawley con el carcinógeno químico 7,12-dimetilbenz(a)antraceno. Los resultados de este trabajo muestran un efecto diferencial de las dietas hiperlipídicas sobre el peso y la masa corporal de los animales, que aumentaron por efecto de la dieta M20. Por el contrario, la dieta mO20 no modificó estos parámetros, y según los resultados obtenidos podría ser debido, al menos en parte, a que favorecería la disipación de la energía disminuyendo, por tanto, su almacenamiento. Por otro lado, ambas dietas hiperlipídicas adelantaron el inicio de la pubertad, aunque el efecto fue superior en el caso de la de aceite de maíz, observándose clínica, morfológica y molecularmente, una maduración sexual a edad más temprana. Asimismo, la caracterización morfológica y molecular de la glándula mamaria reveló un posible aumento de la susceptibilidad a la transformación neoplásica por efecto de les dietas hiperlipídicas, principalmente la M20, que aumentó el número de estructuras epiteliales indiferenciadas, parámetros relacionados con la proliferación celular e índices de estrés oxidativo. En cuanto al estudio de la carcinogénesis, se ha constatado que la dieta rica en aceite de maíz ejerció un claro efecto estimulador, fundamentalmente promotor, de la carcinogénesis mamaria experimental que se manifestó en un menor tiempo de latencia, mayor número de animales afectados, y el elevado contenido y volumen tumorales, así como unas características tumorales de mayor grado histopatológico, necrosis tumoral y reacción estromal. Por su parte, la dieta rica en aceite de oliva mostró una influencia similar a la de la dieta normolipídica en una primera fase del estudio, mientras que para períodos más largos se observó un débil efecto estimulador. A pesar de ello, los adenocarcinomas de los animales alimentados con dicha dieta fueron de menor histopatológico de malignidad que los de la dieta M20. En relación a los mecanismos mediante los cuales las dietas ejercerían sus efectos se hallaría la disminución de la capacidad antioxidante en glándula mamaria, aunque dicha situación no se observó en tumores. Por otra parte, la determinación del perfil de expresión génica mediante microarrays mostró un efecto diferencial de ambas dietas. Así, la dieta rica en aceite de maíz, pero no la de aceite de oliva, disminuyó la expresión de genes implicados en la respuesta inmunitaria y la apoptosis tanto en glándula mamaria como en tumores. En conclusión, los datos obtenidos muestran una clara influencia de la dieta rica en PUFA n-6 sobre la maduración sexual y la carcinogénesis mamaria experimental, mientras que la rica en aceite de oliva virgen extra muestra un efecto más parecido a la dieta control normolipídica, y pone de relevancia la trascendencia de los hábitos dietéticos desde edades tempranas.Breast cancer is the most common malignancy in women worldwide. Several epidemiological and, mainly, experimental evidences have shown that environmental factors, especially nutritional ones, have a role in the etiology and development of this disease. Furthermore, advance of puberty have been described as a risk factor for breast cancer, as well as that time of menarche is determined, largely, by the nutritional status. The aim of this work was to study the modulatory effects of diets high in corn oil (M20), rich in n-6 PUFA, and extra virgin olive oil (mO20), rich in n-9 MUFA and bioactive compounds, administered from prepuberty or in adulthood, on sexual maturation and experimental mammary carcinogenesis, as well as some of the molecular mechanisms by which such effects could be exerted. The experimental model of mammary tumors chemically induced with 7,12-dimethylbenz(α)anthracene (DMBA) in the female Sprague-Dawley rat has been used. The results of this work showed a differential effect of these high fat diets on body weight and mass, which were increased by the M20 diet. On the contrary, the diet rich in olive oil (mO20) did not modify such parameters, and the data obtained indicate that this could be due, at least in part, to an effect on energy dissipation therefore decreasing its storage. Moreover, both high fat diets advanced puberty onset, such effect being stronger by the high corn oil diet. Thus, animals fed the M20 diet showed clinical, morphological and molecular parameters of earlier sexual maturation. Furthermore, morphological and molecular characterization of the mammary gland suggested an increase in the susceptibility to neoplastic transformation by both high fat diets, especially the M20, which increased the number of undifferentiated epithelial structures, parameters related to cell proliferation, and oxidative stress indexes. In relation to the carcinogenesis study, results indicated that the high corn oil diet exerted a clear stimulating effect on experimental breast cancer, mainly in the promotion stage. Such effect was observed by the lower latency time, higher number of tumor-bearing animals, and the increased tumor yield and volume, in addition to the anatomopathological characteristics (higher histological degree, necrosis and stromal reaction). On the other hand, the diet rich in olive oil had a similar influence than the low fat control diet in the first stages of the study, whereas for longer periods it showed a weak stimulatory effect. Nevertheless, adenocarcinomas from animals fed the high olive oil diet displayed a lower histopathological degree of tumor malignancy than those from the M20 diet. In relation to the mechanisms by which high fat diets could exert their effects we found a decrease in the antioxidant capacity in the mammary gland, although such decrease was not observed in adenocarcinomas. Moreover, determination of gene expression profile by microarrays revealed a clear differential effect of the high fat diets. Thus, the diet rich in corn oil, but not high olive oil diet, decreased the expression of genes related to immune response and apoptosis, both in mammary gland and in tumors. In conclusion, the results of this work showed a clear influence of the diet rich in n-6 PUFA on sexual maturation and experimental mammary carcinogenesis, whereas the diet rich in extra virgin olive oil had an effect similar to that of the low fat control diet, highlighting the importance of dietary habits from an early age

Pluripotent stem cells as research models : the examples of trinucleotide repeat instability and X-chromosome inactivatio

Els models de malalties són una eina bàsica per la comprensió de les malalties humanes. Actualment, la majoria de la informació de la que disposem de malalties humanes es basa en models animals. Tot i això, els models animals difereixen molecular i fenotípicament dels humans, i no sempre reprodueixen fidelment la malaltia humana. En les últimes dècades, les cèl·lules mare humanes s'han establert com una opció molt interessant en el camp de la modelització cel·lular. En aquest treball hem volgut caracteritzar les cèl·lules mare embrionàries com a models per a l'estudi de la inestabilitat de la repetició de trinucleotids a la distròfia miotonica tipus 1 (DM1) i la malaltia de Huntington (HD). Així mateix, hem volgut estudiar la inactivació del cromosoma X amb la intenció de fer servir linees cel·lulars com a models per l'estudi del desenvolupament embrionàri humà. A la primera part d'aquest treball, hem observant una inestabilitat de repeticions de trinucleotids significativa al locus de la malaltia DM1 de les cèl·lules mare estudiades. La diferenciació d'aquestes cèl·lules va estabilitzar el número de repeticions. L'estabilització de les repeticions va ser concomitant amb la regulació a la baixa de l'expressió de gens involucrats en els mecanismes de reparació cel·lular. Posteriorment a la publicació del nostre article, altres grups varen reproduir els nostres resultats, però en aquest cas utilitzant cèl·lules mare induïdes. Els estudis recolzen la reproductibilitat dels nostres resultats, suggerint que poden ser extrapol·lats a altres linees de cèl·lules mare arreu del mon. Referent a la mutació de HD, varem trobar que era estable en totes les condicions estudiades, en cèl·lules indiferenciades, diferenciades a progenitors d'os, teratomes i progenitors neurals. Aquests resultats estan en concordancia amb els resultats obtinguts per altres grups que descriuen un baix nombre de repeticions al locus de HD. Per altra banda, varis grups han descrit la presencia de inestabilitat de les repeticions en cèl·lules diferenciades a la linea neural. La discrepància entre els nostres resultats i aquests últims podria ser deguda a la obtenció de cèl·lules neurals menys madures en el moment del nostre estudi. A la segona part d'aquesta tesis hem estudiat la inactivació del cromosoma X en 23 línies femenines de cèl·lules mare pluripotents. Vàrem observar una ràpida progressió de les cèl·lules de dependència de XIST en la inactivació del cromosoma X cap a un estat d'adaptació al cultiu que es caracteritza per un estadi de inactivació independent de l'expressió de XIST i amb una erosió de la metilació. També describim un patró d'inactivació esbiaixat en la majoria de les línies estudiades, contrari al patró aleatori observat en cèl·lules femenines adultes. A més a més, aquest patró és independent de XIST, de l'origen del cromosoma X i d'aberracions cromosòmiques. Aquests resultats suggereixen que el patró esbiaixat observant esta dirigit provablement per l'activació o repressió d'al·lels específics que es troben en el cromosoma X i que li confereixen a la cèl·lula un avantatge respecte a les altres cèl·lules. En conclusió, les cèl·lules mare pluripotents semblen ser un bon model in vitro per a l'estudi d'ambdues malalties, DM1 i HD, ja que presenten el mateix patró d'inestabilitat de la repetició del trinucleotid que s'observa in vivo. Cal remarcar també la depencia Overall, hPSC appear to be a good in vitro model for the study of both DM1 and HD TNR instability, as the repeat follows in vitro the same patterns as found in vivo, including its dependency of the 12R machinery, particularly in the case of DM1. However, our results on the study of the X chromosome inactivation (XCI) state suggest caution when using hPSC as early human developmental research models. The eroded state of XCI found in many of the hPSC lines, and the frequency of skewed XCI patterns suggests that these cells are not a good proxy to early embryonic cells, at least what XCI is concerned. Conversely, they may still provide an interesting model to study gene function and mechanisms implicatedDisease modelling is an essential tool for the understanding of human disease. Currently, much of the information we have on human diseases is based on animal models. However, animal models differ molecularly and phenotypically from humans, and are not always suitable to reproduce with fidelity human diseases. In the past decades, human pluripotent stem cells (hPSC) have emerged as an interesting option in the field of cellular modelling, this development recently having taken up much momentum. In this work, we aimed at characterizing hPSC as models for the study of Myotonic dystrophy type 1 (DM1) and Huntington's disease (HD) trinucleotide repeat (TNR) instability and to investigate the status of the X-chromosome inactivation with an eye on using these cells as models for early human development. In the first part of our work, we observed a significant TNR instability for the DM1 locus in hESC, and that differentiation resulted in a stabilization of the repeat. This stabilization was concommitant with a downregulation of the mismatch repair (MMR). Our results were later replicated in hiPSC by other researchers, showing their reproducibility and suggesting they may be extrapolated to other hPSC lines worldwide. Regarding the HD repeat, we found it was very stable in all conditions studied, both in undifferentiated hESC and cells differentiated into osteogenic progenitor-like cells, teratoma cells and neural progenitors. This is in line with other studies showing that hESC show very limited TNR in the HD locus. On the other hand, some groups have now reported some instability of this locus in cells differentiated into the neuronal lineage. The instability seen in neuronal lineage in later studies, not in our study, is probably explained by the use of hPSC derived neurons more similar to the cells showing in vivo instability than the ones we were able to generate at the time of the study. In the second part of the thesis we studied the X-chromosome inactivation in 23 female hPSC lines. We found that hPSC rapidly progress from a XIST-dependent XCI state to a culture-adapted, XIST-independent XCI state with loss of repressive histone modifications and erosion of methylation. We also report a remarkably high incidence of non-random XCI patterns, and that this skewing of the methylation patterns is independent from the transition to the XIST-independent XCI state, the origin of the X chromosome or chromosomal aberrations. These results suggest that XCI skewing is possibly driven by the activation or repression of a specific allele on the X chromosome, conferring a growth or survival advantage to the cells. Overall, hPSC appear to be a good in vitro model for the study of both DM1 and HD TNR instability, as the repeat follows in vitro the same patterns as found in vivo, including its dependency of the MMR machinery, particularly in the case of DM1. However, our results on the study of the X chromosome inactivation (XCI) state suggest caution when using hPSC as early human developmental research models. The eroded state of XCI found in many of the hPSC lines, and the frequency of skewed XCI patterns suggests that these cells are not a good proxy to early embryonic cells, at least what XCI is concerned. Conversely, they may still provide an interesting model to study gene function and mechanisms implicated

Prevenció de la gestació múltiple en un programa de donació d'oòcits

La gestació múltiple està considerada una complicació de les Tècniques de Reproducció Assistida, especialment significativa en programes de Donació d'Oòcits (DO). No obstant, hi ha pocs autors que hagin avaluat el problema i establert els criteris a aplicar per a reduir-la. Els objectius d'aquesta tesi van incloure: 1)Descriure la incidència de les complicacions obstètriques i perinatals en els embarassos únics i múltiples, així com l' impacte addicional de l'edat de les receptores; 2) Analitzar els factors associats a l'embaràs múltiple en el programa de DO; 3) Avaluar les taxes acumulades (cicles de transferència d'embrions en fresc més cicles de transferència d' embrions criopreservats) d'embaràs i nascut viu en els cicles de DO on s'havia realitzat la transferència selectiva d'un embrió (TES-1), en comparació amb els cicles amb transferència selectiva de dos embrions (TES-2); 4)Avaluar els resultats de l'aplicació del canvi d'estratègia de transferència embrionària de dos embrions cap a un embrió en el nostre programa de DO. Pel primer objectiu es va dur a terme mitjançant un estudi retrospectiu observacional de 225 gestacions úniques, 113 múltiples i 447 nens nascuts, on el cicle de recepció, l'embaràs i el part es controlaren en el nostre centre. Els resultats demostraven que, en les gestacions múltiples de DO, existia una major incidència de complicacions obstètriques (preeclàmpsia, ruptura prematura de membranes, cesàries i part preterme) i perinatals (baix pes al néixer, ingrés en cures intensives i mortalitat perinatal) que en les gestacions úniques. L'edat (≥40 anys) incrementava la incidència de diabetis gestacional i de cesàries. Pel segon objectiu, es va dur a terme un estudi retrospectiu de 945 cicles de recepció on s'havien transferit dos embrions (dia +2). Entre les variables estudiades, la qualitat embrionària va ser l'únic factor associat a la gestació múltiple. El risc de gestació múltiple era el doble si es transferien dos embrions òptims que dos no òptims. El tercer objectiu es va desenvolupar a través de tres estudis on es varen avaluar les taxes acumulades de gestació i nascut viu: i) un estudi retrospectiu per comparar els resultats de 1073 cicles TES-2 en dia+2, versus 66 cicles amb TES-1; ii) un segon estudi prospectiu aleatoritzat, que comparà els resultats de 34 cicles de TES-1 i 31 de TES-2 quan es disposava de mínim 5 embrions amb almenys 2 d'òptima qualitat en dia +3; iii) un estudi prospectiu analític aplicant els criteris establerts en la pràctica clínica per aconsellar TES-1 i que inclogué 297 cicles de TES-1 i 203 de TES-2. Es va concloure que en receptores de bon pronòstic, les taxes acumulades d'embaràs i nascut viu eren similars en les dues estratègies. No obstant, tot i que amb la transferència d'un embrió es reduïa la taxa de múltiples, es necessitava més temps per aconseguir la mateixa taxa d'èxit. Pel darrer objectiu, es va analitzar de forma retrospectiva la transferència d'un embrió en el període 2004-2014. Es va posar de manifest que la implementació de criteris mèdics i embriològics havia suposat un increment de transferència d'un embrió de 2.6% a 43.1%, amb una reducció de la taxa de gestació múltiple del 30% al 22.5% i sense una reducció clínicament rellevant de la taxa de gestació i nascut viu. Els resultats varen demostrar que, aplicant criteris mèdics i embriològics per transferir un embrió, s'aconseguia augmentar el percentatge de transferències úniques i reduir la taxa de gestació múltiple sense que es veiessin afectades les taxes acumulades de gestació i nascut viu. Tot i així, es necessitava més temps per aconseguir la mateixa taxa de gestació.Multiple pregnancy is regarded as a complication of assisted reproductive technologies, especially significant in oocyte donation programmes (OD). However, few authors have assessed this issue or established criteria to reduce it. The objectives of this thesis were 1) to describe the incidence of obstetric and perinatal complications in single and multiple pregnancies, as well as the additional impact of recipient age; 2) to analyse the main factors associated with multiple pregnancy in the OD programme; 3) to assess the cumulative (fresh embryo transfer cycles plus frozen-thawed embryo transfer cycles) pregnancy and live birth rates in OD cycles with elective single embryo transfer (SET) compared with elective double-embryo transfer (DET); 4) to evaluate the results of implementing a strategy shift from transferring two embryos to transferring one in our OD programme. The first objective was accomplished through a retrospective observational study of 225 singleton pregnancies, 113 multiple and 447 live births, in which the reception cycle, pregnancy follow-up and labour were performed at our centre. The results showed that in multiple pregnancies from OD there was a higher incidence of obstetric (preeclampsia, premature rupture of membranes, caesarean sections and preterm delivery) and perinatal (low birth weight, admissions to the intensive care unit and perinatal mortality) complications than in singleton pregnancies. The incidence of gestational diabetes and caesarean section increased with age (≥40 years). For the second objective, a retrospective study of 945 reception cycles in which two embryos had been transferred (on day 2) was carried out. Among the variables analysed, embryo quality was the only associated factor. The risk of multiple gestation was twofold when two good-quality embryos were transferred compared with two non-good-quality embryos. The third objective was developed through three studies that evaluated the cumulative pregnancy and live birth rates: i) a retrospective study to compare the outcomes of 1073 cycles in which DET was performed on day 2, with 66 SET cycles; ii) a randomised prospective study comparing the results of 34 SET cycles with 31 DET cycles when there were a minimum of 5 embryos available with at least 2 good-quality embryos on day 3; iii) an analytic prospective study, with the application of the criteria established in clinical practice for the purpose of recommending SET, which included 297 SET and 203 DET cycles. We concluded that in good-prognosis recipients, cumulative pregnancy and live birth rates are similar in both strategies. However, although the multiple pregnancy rate was lower in SET, the time needed to achieve the same success rate was higher. For the last objective, we retrospectively analysed single-embryo transfers from 2004 until 2014. This analysis revealed that the application of medical and embryologic criteria led to an increase in single-embryo transfers from 2.6% to 43.1%, with a decrease in multiple pregnancy rates from 30% to 22.5%, without a clinically relevant reduction in the pregnancy and live birth rates. These results show that by applying medical and embryologic criteria to transfer one embryo, it is possible to increase the percentage of single-embryo transfers and reduce the multiple gestation rate without affecting the cumulative pregnancy and live birth rates. However, the time to pregnancy is higher when one embryo is transferred

Estudio de variantes estructurales del genoma humano asociadas a trastornos del neurodesarrollo /

BibliografiaEl síndrome de Angelman (SA) y el de Prader Wili (SPW) son trastornos del neurodesarrollo cuya principal etiología molecular es la deleción de la región 15q11.2-q13. Esta deleción está promovida por la Recombinación Homóloga No Alélica (NAHR) y mediada por secuencias altamente repetitivas de bajo número de copias (LCRs) que la flanquean. La orientación de estas LCRs predispone al reordenamiento final que se obtendrá por NAHR. Las LCRs en orientación directa generan deleciones y duplicaciones mientras las que presentan orientación invertida originan inversiones. Estas inversiones pueden facilitar una recombinación inadecuada entre las LCRs que flanquean la región 15q11.2-q13 dando lugar a la deleción en la descendencia. En este trabajo se presenta un nuevo análisis de la frecuencia de la inversión 15q11.2-q13 en 23 controles de población general, 21 progenitores de pacientes con SA y 32 con descendencia por SPW. Se han analizado un total de 9540 cromosomas informativos mediante FISH de sondas de BACs, encontrando la inversión en el 4,61% de los cromosomas estudiados en la población control. También se ha analizado la frecuencia de la inversión en progenitores de pacientes con SA y SPW observando un incremento significativo de inversiones en las madres de hijos con SA por deleción y en los padres de SPW por deleción frente a la población control (p=8x10-7 y p=0.007, respectivamente). Nuestros resultados indican que la inversión 15q11.2-q13 es un polimorfismo presente en población general. Así mismo, el incremento de la frecuencia de la inversión en madres de SA y padres de SPW con deleción sugiere que la inversión podría ser una estructura que promueve el mal alineamiento de los LCRs y facilita la generación de deleciones en 15q11.2-q13. El SA es diagnosticado molecularmente en el 90% de los pacientes, sin embargo, en el 10% restante, aún presentando unas características clínicas bien definidas, su etiología molecular es todavía una incógnita (SA-like). Se han analizado 20 pacientes SA-like mediante a-CGH previo cribado de variaciones en número de copias (CNVs) en regiones sindrómicas y subteloméricas. Las regiones variables en número de copia con una frecuencia poblacional inferior al 5% o que no se encuentran estudiadas según la Database of Genomic Variants se han seleccionado para ser confirmadas mediante Multiplex Ligation-depenent Probe Amplificatio (MLPA). Se han evaluado las CNVs en 20 pacientes SA-like y sus progenitores y se ha ampliado el estudio para cribar pacientes con discapacidad intelectual (n=296), trastornos del espectro autista (n=164) y controles de población general española (n=453). Se ha identificado una deleción de novo (1q44), dos duplicaciones heredadas de la madre (Xp11.23 y Xq28) y 20 regiones heredadas con CNVs en los pacientes SA-like pero que no se observan en la población control. En tres pacientes la concomitancia de una deleción y un SNP puede estar originando una discapacidad intelectual de herencia recesiva, sugiriendo que el gen MYH13 y los ARNs no codificantes largos podrían estar involucrados en el fenotipo SA-like. En lo referente a los pacientes con discapacidad intelectual y trastornos del espectro autista se han identificado alteraciones de gran tamaño implicadas en la etiología: del(1)(p36), del(1)(q44), dup(10)(q21.1), dup(X)(q11.23q28) y dup(X)(q28) en tres casos. También se han detectado 29 regiones con CNVs heredadas que no son variables en población general, 12 de las cuales son compartidas con los pacientes SA-like. Nuestros resultados respaldan la idea de que regiones con CNVs pueden ser, probablemente, responsables de un alto porcentaje de trastornos del neurodesarrollo. Las CNVs identificadas en pacientes, pero no detectadas en población control, aún siendo heredadas, podrían estar asociadas a algunas características clínicas de la enfermedad desenmascarando, en genes específicos, mutaciones de carácter recesivo relacionados con los fenotipos.Angelman syndrome (AS) and Prader Willi syndrome (PWS) are neurodevelomental disorders in which main molecular etiology is the 15q11.2-q13 deletion. This deletion is leaded by Non Allelic Homologous Recombination (NAHR) mediated by flanking high repetitive sequences named Low Copy Repeats (LCRs). The orientation of these LCRs leads the final product of NAHR. LCRs in direct orientation are solved in deletions or duplications while LCRs in inverted orientation lead inversions. These inversions could facilitate abnormal recombination between flanking LCRs and could mediate interstitial deletion of chromosome 15q11.2-q13 in the offspring. Herein we report a new analysis of the frequency of inversion 15q11.2-q13 in 23 controls from general population, 21 AS parents and 32 PWS parents. Molecular cytogenetic analysis was performed using FISH with BACs probes by examining a total of 9540 informative chromosomes. First, the 15q11.2-q13 inversion was detected on average in 4.61% of chromosomes of Spanish control population. Then we analyzed the frequency of the 15q11.2-q13 inversion in parents of AS and PWS and a significant increase in AS mothers and PWS fathers with offspring affected by deletion was observed in front of control group (p= 8x10-7and p=0,007, respectively). Our results indicate that 15q11.2-q13 inversion is a polymorphism presents in general population. Moreover, the high inversion frequency observed in AS mothers and PWS fathers of offspring affected by deletion suggest that the inversion could be a structure that promotes misalignment between the LCRs and facilitates the occurrence of 15q11.2-q13 deletions. AS has a recognizable molecular cause in about 90% of cases, nevertheless in 10% with well-defined clinical features the molecular etiology is still unknown (AS-like). We have analysed 20 AS-like patients by a-CGH after screening the patients for syndromic and subtelomeric copy number alterations (CNVs). Regions that contained rare CNVs or not reported in the Database of Genomic Variants were selected for validation using custom Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) assays. We assessed the CNV status in the 20 AS-like cases and in their parents, and also expanded the study to larger sets of samples of individuals suffering idiopathic intellectual disability (n=296), autism spectrum disorders (n=164) as well as to a control cohort of normal individuals (n=453). We have identified one de novo deletion (1q44), two maternally inherited duplications (Xp11.23 and Xq28) and 20 inherited altered regions present in AS-like cases that have not been present in control population. In three patients a concomitance of a deletion and SNPs is leading a possible recessive intellectual disability disease suggesting that MYH13 and long non-coding RNAs could be involved in AS-like. Concerning intellectual disability and autism spectrum disorders big alterations: del(1)(p36), del(1)(q44), dup(10)(q21.1), dup(X)(q11.23q28) and dup(X)(q28) in three patients, have been associated with the etiology. We also have identified 29 inherited genomic variants that were not present in the general population, 12 out of them shared with AS-like patients. Our results support the point of view that a considerable proportion of genomic regions showing variability in copy number could be responsible for neurodevelopment disorders. The inherited CNVs identified in cases, but not detected in controls, suggesting that even if they are inherited, they could be responsible for some of the clinical features perhaps unmasking, in specific genes, recessive mutations involved in the phenotypes

Lípidos de la dieta y cáncer de mama experimental: efectos sobre el estrés oxidativo /

El cáncer de mama es el más frecuente en mujeres de todo el mundo. Además de los factores genéticos, epigenéticos y hormonales, existen evidencias epidemiológicas y experimentales de que los factores nutricionales y ambientales tienen un papel en la etiología y el desarrollo de esta enfermedad. Los lípidos de la dieta se han relacionado directamente con el cáncer, fundamentalmente, el de mama. Resultados previos demostraron que las dietas hiperlipídicas de aceite de maíz, rico en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) n-6, y el aceite de oliva virgen extra, rico en ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) n-9 y diversos compuestos bioactivos, ejercen un efecto estimulador y potencialmente protector, respectivamente, en el cáncer de mama experimental. Estos efectos se realizan durante la etapa de la promoción de la carcinogénesis, pero existen indicios de una influencia sobre la iniciación. El objetivo de este trabajo fue investigar si estos lípidos podían ejercer sus efectos moduladores mediante cambios en el estado de estrés oxidativo en el organismo a diferentes niveles: en el animal sano, en la etapa de la iniciación de la carcinogénesis y en el animal adulto afectado de cáncer de mama. Así, se desarrolló una serie experimental basada en el modelo de cáncer de mama inducido en la rata Sprague Dawley con el hidrocarburo aromático policíclico 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA). Se estudiaron la defensa antioxidante enzimática, mediante la expresión de las enzimas CAT, SOD1, SOD2, GPX1, GPX4 y GR en hígado y glándula mamaria y su actividad en hígado, y la no-enzimática, mediante los parámetros del glutatión en plasma GSHtotal, GSH, GSSG, GSH/GSHtotal y GSH/GSSG. Además, se estudió el daño oxidativo en lípidos y proteínas en plasma, y en el ADN de la glándula mamaria, mediante los niveles de 8-OHdG y la expresión de las enzimas de reparación OGG y PARP. Los resultados mostraron que, en general, las dietas hiperlipídicas aumentaron el nivel de estrés oxidativo en comparación a la dieta control. Este efecto fue mayor para la dieta de aceite de maíz, tanto en los animales sanos como, sobre todo, en la etapa de la iniciación de la carcinogénesis. Ello se correspondió con una aparición más temprana de la enfermedad y mayores incidencia y contenido tumorales. En cambio, la dieta rica en aceite de oliva tuvo un efecto débilmente estimulador de la carcinogénesis y se asoció a unos niveles de estrés oxidativo en hígado y plasma intermedios entre los inducidos por la dieta de aceite de maíz y la control, tanto en los animales sanos como durante la iniciación. En la glándula mamaria iniciada los lípidos de la dieta ejercieron sus efectos sobre los parámetros de estrés mediante mecanismos específicos. Finalmente, los lípidos de la dieta ejercieron una influencia mucho menor sobre el estrés oxidativo una vez el cáncer está establecido.Breast cancer is the most common malignancy among women all over the world. Besides the genetic, epigenetic and hormonal factors, there are epidemiologic and experimental evidences that nutritional and environment factors have a role in the etiology and the development of this cancer. The dietary lipids are directly related with cancer, mainly breast cancer. Previous results have demonstrated that high corn oil, rich in polyunsaturated fatty acids (PUFA) n-6, and the high extra virgin olive oil diets, rich in monounsaturated fatty acids (MUFA) n-9 and several bioactive compounds, in the experimental breast cancer, resulting in a stimulating and a potentially protective effect, respectively. These diets mostly acted on the carcinogenesis promotion stage, but there are evidences of their action on the initiation stage. The aim of this study was to investigate whether these lipids could exert their modulatory effects through changes on the oxidative stress state in the organism at different levels: in the healthy animal, in the carcinogenesis initiation stage and in the tumor-bearing adult animal. Results proceed from and experimental series, developed in the breast cancer model induced in the Sprague-Dawley rat with the polycyclic aromatic hydrocarbon 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA). The antioxidant enzymatic defense was studied through CAT, SOD1, SOD2, GPX1, GPX4 and GR expression on the liver and mammary gland, and the non-enzymatic defense through total GSH, GSH, GSSG, GSH/GSHtotal and GSH/GSSG glutathione parameters in plasma. Furthermore, plasmatic oxidative damage in lipids and proteins, and DNA damage in the mammary gland though 8-OHdG levels and reparation OGG and PARP reparation damage enzymes were determined. Results showed that, high fat diets increased oxidative levels comparing with the control diet. The high corn oil diet showed a higher effect, both in healthy and especially in the carcinogenesis initiation stage. This was in accordance with an earlier tumor appearance and higher tumor content due to the high corn oil diet. On the other hand, the high extra virgin olive oil diet showed a weak stimulatory c effect which was associated with intermediate oxidative stress levels in serum and liver between the high corn oil and control diets, both in healthy and initiated animals. In the initiated mammary gland, dietary lipids exerted their effects on the oxidative stress parameters through specific mechanisms. Finally, once cancer disease was established, dietary lipids exerted a much lower effect

Anàlisi del contingut cromosòmic en espermatozoides d'individus portadors de translocacions : relació entre efecte intercromosòmic i segregació /

Els individus portadors de translocacions cromosòmiques equilibrades presenten un risc incrementat de produir gàmetes amb anomalies cromosòmiques, ja sigui per una segregació desequilibrada dels cromosomes reorganitzats o per la formació d'anomalies numèriques derivades de l'efecte intercromosòmic. Es desconeix si existeix una relació entre les anomalies derivades d'ambdós esdeveniments, que podria residir en l'aparició de fenòmens d'heterosinapsi entre els multivalents i altres cromosomes durant la profase I. D'altra banda, l'heterosinapsi s'ha relacionat amb canvis en l'arquitectura nuclear dels cromosomes en espermatozoides, que en última instància també podrien afectar la fertilitat dels individus portadors. Els objectius d'aquesta tesi han estat: i) Desenvolupar un mètode d'anàlisi seqüencial basat en tècniques d'hibridació in situ fluorescent (FISH) que permeti identificar anomalies cromosòmiques numèriques i determinar el mode de segregació dels cromosomes reorganitzats sobre els mateixos espermatozoides; ii) Caracteritzar els patrons de segregació de diferents reorganitzacions cromosòmiques en espermatozoides no seleccionats i en espermatozoides portadors d'anomalies numèriques; iii) Determinar si existeix una relació entre els diferents modes de segregació dels cromosomes reorganitzats i la producció d'espermatozoides amb anomalies numèriques; iv) Desenvolupar una tècnica d'anàlisi que permeti valorar la disposició tridimensional dels territoris cromosòmics en nuclis d'espermatozoides. S'han recollit mostres de semen de vuit individus portadors de translocacions recíproques, onze portadors de translocacions Robertsonianes i un portador d'una triple translocació. En la primera ronda de FISH seqüencial s'han detectat espermatozoides amb anomalies numèriques per cinc cromosomes no relacionats amb la reorganització. En la segona ronda s'han analitzat els productes de segregació dels cromosomes reorganitzats en els espermatozoides amb anomalies numèriques detectats prèviament, així com en espermatozoides no seleccionats. L'optimització del sistema d'anàlisi de la disposició dels territoris cromosòmics en el nucli espermàtic ha inclòs la selecció de nuclis segons el seu genotip, la captura d'imatges tridimensionals, la relocalització dels nuclis d'interès, el tractament digital de les imatges, la normalització de les dades i l'obtenció dels valors de posicionament dels centròmers en l'eix longitudinal i radial de l'espermatozoide. Els resultats de l'anàlisi de segregació en espermatozoides no seleccionats mostren una elevada homogeneïtat dels patrons de segregació entre portadors del mateix tipus de translocació, caracteritzats per una elevada freqüència dels modes de segregacions que impliquen la disjunció a pols cel·lulars oposats dels cromosomes amb centròmers homòlegs. Els resultats de segregació en espermatozoides aneuploides i diploides/múltiples disòmics mostren un patró de segregació alterat respecte els espermatozoides no seleccionats, on s'afavoreixen els modes de segregació desequilibrats, en detriment dels productes de segregació equilibrats. Els espermatozoides amb diferents tipus d'aneuploïdies i amb diferents cromosomes implicats, influeixen per igual al patró de segregació alterat. Els resultats sobre el posicionament tridimensional dels cromosomes han permès validar la metodologia desenvolupada, ja que s'ha obtingut informació sobre la localització preferent dels cromosomes estudiats en nuclis amb diferents genotips. Els resultats obtinguts demostren una associació entre la presència d'anomalies numèriques i un contingut desequilibrat dels cromosomes reorganitzats. L'acumulació d'anomalies cromosòmiques en els mateixos gàmetes pot ser atribuïble a un efecte bidireccional de l'heterosinapsi, que comportaria un canvi en la localització nuclear dels cromosomes afectats i una alteració en la formació dels quiasmes. Els problemes d'orientació dels cromosomes a la placa metafàsica poden provocar una aturada meiòtica prolongada, que en cas de no corregir-se, es podria resoldre a través de l'evasió del punt de control. Aquest fet afavoriria la producció de gàmetes que podrien acumular anomalies procedents de segregacions desequilibrades, a més d'aneuploïdies d'altres cromosomes. La tècnica desenvolupada per estudiar l'arquitectura nuclear dels espermatozoides permetrà determinar si les anomalies cromosòmiques presents en els gàmetes dels individus portadors de reorganitzacions cromosòmiques afecten l'organització nuclear global dels cromosomes i condicionen la seva fertilitat.Carriers of chromosomal translocations present a high risk of producing chromosomally abnormal gametes, as a consequence of an unbalanced segregation of the rearranged chromosomes, or the presence of numerical chromosomal anomalies derived from an interchromosomal effect. It is not known whether there exists a relationship between anomalies produced by these two events, but it might be based on the occurrence of heterosynapsis at the meiotic prophase I between multivalents and other chromosomes. Moreover, heterosynapsis has been associated related to changes in the nuclear chromosome architecture in sperm, which may also affect the fertility of reorganization carriers. The objectives of this thesis have been: i) To develop a sequential fluorescence in situ hybridization (FISH) protocol in order to detect numerical chromosomal abnormalities and to establish the segregation mode of rearranged chromosomes in the same spermatozoa; ii) To establish the segregation pattern of different chromosomal rearrangements in random sperm and in sperm with numerical abnormalities; iii) To determine whether there exists a relationship between certain segregation modes and the occurrence of numerical chromosome abnormalities; iv) To develop a methodology to evaluate the tridimensional distribution of chromosome territories in sperm nuclei. Semen samples of eight carriers of reciprocal translocations, eleven carriers of Robertsonian translocations and one carrier of a three-way translocation have been included in the study. In the first sequential FISH round, numerical anomalies for five chromosomes unrelated to the rearrangements have been analysed. In the second round, a segregation analysis has been performed both in the numerically abnormal sperm detected in the first round as well as in randomly assessed sperm. The optimization of the analysis of chromosome territories in sperm nuclei has included: nuclei classification according to their genotype, 3D image recording, relocalization of selected nuclei, digital images editing, data normalization, and prediction of the preferred position of each hybridization signal along the longitudinal and radial axis of spermatozoa. The segregation patterns obtained in randomly assessed sperm show high homogeneity among carriers of the same translocation. These patterns involve high frequencies of segregation modes that entail disjunction to opposite cellular poles of chromosomes with homologous centromeres. Data obtained from segregation analysis in aneuploid and diploid/multiple disomic sperm show altered segregation patterns when compared to randomly assessed sperm, in which unbalanced segregation modes are favoured while balanced segregation products decrease. Aneuploid sperm with different types of chromosomal abnormalities or different chromosomes involved in the aneuploidy have the same effect over the altered segregation pattern. The results obtained in the analysis of chromosome territories allow for the validation of the developed methodology. It has allowed the prediction of the preferred positioning of analysed chromosomes in sperm nuclei with different genotypes. In conclusion, data obtained point out that indeed there exists a relationship between the presence of numerical chromosome abnormalities and an unbalanced segregation content in sperm. This accumulation of chromosome anomalies in the same gametes would be driven by a bidirectional effect of heterosynapsis, which could entail changes in the nuclear positioning of the affected chromosomes, as well as alterations in chiasmata formation. The chromosome misalignment at metaphase plate would cause a meiotic arrest. If unresolved, cells could eventually evade this checkpoint favouring the accumulation of both unbalanced segregation products and aneuploidies for other chromosomes in the same gametes. The developed methodology to study the sperm nuclear architecture can be potentially used in carriers of chromosomal rearrangements, in order to assess whether chromosomal abnormalities in sperm affect the global nuclear chromosome organization and disturb their fertility