New insights into small molecules inhibitors and protein-protein interactions of VirB8 : a critical conserved component of the type IV secretion system

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes.Bacterial Type IV secretion systems (T4SSs) are complexes that are constituted of 8 to 12 conserved proteins and used by many Gram-negative bacteria for the translocation of proteins and DNA-protein complexes as well as for the transport of DNA-protein complexes across their cell envelope. T4SS are excellent model targets for the development of antivirulence drugs as they are essential virulence factor for many bacterial pathogens, such as Brucella suis. Antivirulence drugs that deprive the pathogen of its essential virulence factor, the T4SS, would constitute alternatives to or enhancements of current antibiotic treatment. VirB8, a conserved core assembly factor in T4SS, forms homo- and heterodimers that are very important for T4SS function in these pathogens. Due to its multiple interactions, we hypothesized that VirB8 is an excellent model for the analysis of assembly factors but also a potential target for drugs that could target its protein–protein interactions, which would disarm bacteria by depriving them of their essential virulence functions. The existence of a monomer-dimer equilibrium and self-association of VirB8 were previously demonstrated as being essential for T4SS biological activity. Guided by quantitative interaction assays, we here identified (i) potential interaction sites with other T4SS components and (ii) isolated small molecules inhibitors as probes for protein function. To further determine the residues important for heterodimerization of VirB8 with VirB10, we conducted alanine-scanning mutagenesis, phage display and in silico docking. These experiments demonstrated that residues located on the β sheet R160, S162, T164 and I165. are involved in the association of VirB8 and VirB10 and mutagenesis of these residues led to a decrease in the heterodimer formation. The general objective of our research is to gain quantitative insights into the role VirB8 plays in T4SS assembly. Based on a structure-inspired high-throughput screening approach, we identified a promising compound BAR-068 that inhibits VirB8 interactions in the nM range. We used spectroscopy by fluorescence, a bacterial two-hybrid assay, chemical cross-linking and crystallography in order to decipher the mechanism of interactions of this inhibitor with VirB8. Ultimately, this may lead to advance the understanding of T4SS inhibition. Our ultimate objective is to characterize the sequence of events between VirB8 and other VirB factors that guides T4SS complex assembly and function. Our research will reveal general principles of membrane protein complex assembly that will enhance our knowledge of a number of different areas including bacterial protein secretion. In addition, this research will inform an innovative strategy for the development of novel antimicrobial drugs

Computational analysis of overexpressed protein kinases in «triple-negative» breast cancer.

Résumé : Malgré l’apport de nouvelles armes thérapeutiques, le cancer du sein reste la première cause de décès par cancer chez la femme de moins de 65 ans. Le cancer du sein dit «triple-négatif», un sous-type représentant environ 10 % des cancers du sein, est caractérisé par l’absence de récepteurs hormonaux aux oestrogènes et à la progestérone et aussi par l’absence d’expression du récepteur de croissance HER-2. Ce type de cancer considéré comme étant le plus agressif des cancers du sein, possède un profil clinique défavorable avec un haut risque de rechute métastatique. Les seuls outils thérapeutiques disponibles actuellement contre ce type de cancer sont la chimiothérapie et la radiothérapie, qui s’avèrent être très toxiques pour le patient et ne ciblent pas de manière spécifique la tumeur. Il a été ainsi démontré qu’il existe au sein du kinome (i.e. l’ensemble des protéines kinases du génome humain), 26 protéines kinases surexprimées dans le cancer du sein dit «triple-négatif» et dont le rôle s’avère être critique dans la croissance de ces cellules cancéreuses. Nous avons utilisé différentes méthodes computationnelles développées au sein de notre laboratoire afin de caractériser le site de liaison de l’ensemble de ces 26 protéines kinases. Plus précisément, nous avons calculé les similitudes entre les protéines kinases à plusieurs niveaux: 1. séquence globale, 2. séquence des sites de liaison, 3. structure des sites de liaison et 4. profils de liaison. Nous avons utilisé des outils de visualisation de données afin de mettre en évidence ces similarités. Le profil de liaison de 38 molécules inhibitrices a été déterminé pour un ensemble de 290 protéines kinases humaines, incluant 15 des protéines kinases appartenant à notre sous-ensemble de protéines d'intérêt. Ces profils de liaison sont utilisés pour définir les similarités fonctionnelles entre les protéines kinases d'intérêt, en utilisant le coefficient tau de corrélation des rangs de Kendall ([tau]). Nous avons effectué des simulations d’arrimage à l’aide du logiciel FlexAID, pour chacune des protéines et l’ensemble des 38 molécules inhibitrices afin d’élargir l’analyse précédente aux autres protéines qui n’ont pas été testé par Karaman et al. Grâce aux différentes études structurales et computationnelles effectuées ci-dessus, nous avons été à même de hiérarchiser les protéines kinases en fonction des similarités moléculaires vis-à-vis de leurs profils de liaison, en vue du développement futur d’outils thérapeutiques poly-pharmacologiques. // Abstract : Despite the development of novel therapeutic agents, breast cancer represents a major cause of death among women. Among breast cancer patients, triple negative (TN) breast cancer (TNBC) represents approximately 15% of cases. TNBC is characterized by the absence of the estrogen receptor, the progesterone receptor as well as the HER2 protein kinase. Recently, it has been shown that a subset of 26 protein kinases (TNVT set) is overexpressed in TNBC. Their inhibition in siRNA knockdown experiments leads to varying levels of growth inhibition in TN and sometimes non-TN cancer cell lines. These studies validate TNVT set kinases as potential therapeutic targets. The aim of this project is to characterize the binding site of TNVT set kinases using different computational methods developed in our research group and to determine which protein kinases of this subset could be more likely to bind similar ligands as part of a poly-pharmacological approach. We calculated global sequence similarities, binding-site sequence similarities and 3D atomic binding-site similarities for the TNVT set of kinases. This analysis shows that binding-site sequence similarities somehow reflect global sequence similarities. Binding-site 3D atomic similarities reflect binding-site sequence similarities but are more widespread. This may have potential functional consequences in terms of small-molecule molecular recognition. Such similarities can potentially lead to cross-reactivity effects but they can also be exploited in the development of multi-functional poly-pharmacological drugs. Recently, the dissociation constants (K[indice inférieur d]) of 38 small-molecule inhibitors for 290 protein kinases (including 17 kinases in the TNVT set) were calculated. These experimental bindingprofiles were used to define a measure of functional profile similarity using Kendall rank correlations ([tau]). We will present results using our docking program FlexAID for the 38 small-molecules tested by Karaman et al. against the 26 kinases in the TNVT set. Similar to experimental binding-profiles, the docking scores can be used to define docking bindingprofiles similarities using [tau] rank correlations. Docking binding-profile similarities are then used to cluster the 26 kinases in the TNVT set. Clusters represent subsets of kinases within the TNVT set with functionally similar binding-sites. Finally, we compare functional docking profile similarities to the sequence and 3D atomic similarities discussed above. This analysis will allow us to detect subsets of kinases in the TNVT set for which it may be possible to develop multi-functional inhibitors

Computational analysis of overexpressed protein kinases in «triple-negative» breast cancer.

Résumé : Malgré l’apport de nouvelles armes thérapeutiques, le cancer du sein reste la première cause de décès par cancer chez la femme de moins de 65 ans. Le cancer du sein dit «triple-négatif», un sous-type représentant environ 10 % des cancers du sein, est caractérisé par l’absence de récepteurs hormonaux aux oestrogènes et à la progestérone et aussi par l’absence d’expression du récepteur de croissance HER-2. Ce type de cancer considéré comme étant le plus agressif des cancers du sein, possède un profil clinique défavorable avec un haut risque de rechute métastatique. Les seuls outils thérapeutiques disponibles actuellement contre ce type de cancer sont la chimiothérapie et la radiothérapie, qui s’avèrent être très toxiques pour le patient et ne ciblent pas de manière spécifique la tumeur. Il a été ainsi démontré qu’il existe au sein du kinome (i.e. l’ensemble des protéines kinases du génome humain), 26 protéines kinases surexprimées dans le cancer du sein dit «triple-négatif» et dont le rôle s’avère être critique dans la croissance de ces cellules cancéreuses. Nous avons utilisé différentes méthodes computationnelles développées au sein de notre laboratoire afin de caractériser le site de liaison de l’ensemble de ces 26 protéines kinases. Plus précisément, nous avons calculé les similitudes entre les protéines kinases à plusieurs niveaux: 1. séquence globale, 2. séquence des sites de liaison, 3. structure des sites de liaison et 4. profils de liaison. Nous avons utilisé des outils de visualisation de données afin de mettre en évidence ces similarités. Le profil de liaison de 38 molécules inhibitrices a été déterminé pour un ensemble de 290 protéines kinases humaines, incluant 15 des protéines kinases appartenant à notre sous-ensemble de protéines d'intérêt. Ces profils de liaison sont utilisés pour définir les similarités fonctionnelles entre les protéines kinases d'intérêt, en utilisant le coefficient tau de corrélation des rangs de Kendall ([tau]). Nous avons effectué des simulations d’arrimage à l’aide du logiciel FlexAID, pour chacune des protéines et l’ensemble des 38 molécules inhibitrices afin d’élargir l’analyse précédente aux autres protéines qui n’ont pas été testé par Karaman et al. Grâce aux différentes études structurales et computationnelles effectuées ci-dessus, nous avons été à même de hiérarchiser les protéines kinases en fonction des similarités moléculaires vis-à-vis de leurs profils de liaison, en vue du développement futur d’outils thérapeutiques poly-pharmacologiques. // Abstract : Despite the development of novel therapeutic agents, breast cancer represents a major cause of death among women. Among breast cancer patients, triple negative (TN) breast cancer (TNBC) represents approximately 15% of cases. TNBC is characterized by the absence of the estrogen receptor, the progesterone receptor as well as the HER2 protein kinase. Recently, it has been shown that a subset of 26 protein kinases (TNVT set) is overexpressed in TNBC. Their inhibition in siRNA knockdown experiments leads to varying levels of growth inhibition in TN and sometimes non-TN cancer cell lines. These studies validate TNVT set kinases as potential therapeutic targets. The aim of this project is to characterize the binding site of TNVT set kinases using different computational methods developed in our research group and to determine which protein kinases of this subset could be more likely to bind similar ligands as part of a poly-pharmacological approach. We calculated global sequence similarities, binding-site sequence similarities and 3D atomic binding-site similarities for the TNVT set of kinases. This analysis shows that binding-site sequence similarities somehow reflect global sequence similarities. Binding-site 3D atomic similarities reflect binding-site sequence similarities but are more widespread. This may have potential functional consequences in terms of small-molecule molecular recognition. Such similarities can potentially lead to cross-reactivity effects but they can also be exploited in the development of multi-functional poly-pharmacological drugs. Recently, the dissociation constants (K[indice inférieur d]) of 38 small-molecule inhibitors for 290 protein kinases (including 17 kinases in the TNVT set) were calculated. These experimental bindingprofiles were used to define a measure of functional profile similarity using Kendall rank correlations ([tau]). We will present results using our docking program FlexAID for the 38 small-molecules tested by Karaman et al. against the 26 kinases in the TNVT set. Similar to experimental binding-profiles, the docking scores can be used to define docking bindingprofiles similarities using [tau] rank correlations. Docking binding-profile similarities are then used to cluster the 26 kinases in the TNVT set. Clusters represent subsets of kinases within the TNVT set with functionally similar binding-sites. Finally, we compare functional docking profile similarities to the sequence and 3D atomic similarities discussed above. This analysis will allow us to detect subsets of kinases in the TNVT set for which it may be possible to develop multi-functional inhibitors