Identificación y caracterización de nuevos defectos del metabolismo energético mitocondrial asociados a aciduria 3-metilglutacónica y a deficiencia del complejo I

[spa] Las enfermedades del metabolismo energético mitocondrial son un grupo de patologías con una gran heterogeneidad clínica, bioquímica y genética. Aunque en la última década la implementación de las técnicas de “Next generation sequencing” (NGS) ha permitido la identificación de un importante número de genes asociados a estas enfermedades, el diagnóstico de estos pacientes sigue siendo muy complejo. Por ello, la identificación y el estudio de biomarcadores para estas enfermedades es fundamental, ya que permite dirigir la interpretación de los datos genéticos y el diagnóstico hacia vías metabólicas o funciones celulares concretas. Un biomarcador ampliamente aceptado como indicador de alteración mitocondrial es la elevación de ácido 3-metilglutacónico (3-MGA) en orina, que es el hilo conductor de esta tesis doctoral. Los niveles elevados y persistentes de este metabolito se asocian a defectos en proteínas asociadas a la membrana mitocondrial entre las que se encuentran ciertas deficiencias del complejo V de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM). Por otro lado, la alteración más frecuente entre las patologías mitocondriales es la deficiencia del complejo I. En base a los conocimientos previos sobre la afectación mitocondrial en estos trastornos, la hipótesis de esta tesis es que la implementación de herramientas de caracterización mitocondrial facilitará la priorización e identificación de las variantes genéticas causantes de la enfermedad. Nuestros estudios se han centrado en la caracterización de la morfología mitocondrial, el ensamblaje de los complejos y supercomplejos de la CRM y la respiración celular. Además, en cada uno de los casos incluidos en este trabajo, se han realizado estudios más específicos relacionados con el gen alterado, dando en su conjunto una amplia visión de las bases moleculares subyacentes en cada patología. En esta tesis se han estudiado un total de 36 pacientes con sospecha de enfermedad mitocondrial en los que se han realizado análisis genéticos y estudios funcionales en células de los pacientes o en modelos celulares. En 14 pacientes se observó aciduria 3-metilglutacónica (3-MG), habiéndose conseguido un diagnóstico genético definitivo en 11 de ellos. En 17 de los 22 pacientes restantes, los estudios funcionales realizados han permitido confirmar la causalidad de las variantes identificadas. Asimismo, estos estudios han descartado la patogenicidad de las variantes candidatas en 5 casos. El estudio de las bases moleculares de las enfermedades causadas por mutaciones en TIMM50, HACE1, NDUFAF4 y NDUFA8 ha dado lugar a las 4 publicaciones que conforman el grueso de esta tesis doctoral. En el primer artículo, presentamos un paciente con síndrome de Leigh, atrofia óptica, neutropenia, cardiomiopatía y aciduria 3-MG en el que se identificaron dos mutaciones en heterocigosis compuesta en el gen TIMM50 (c.341G>A; p.Arg114Gln y c.805G>A; p.Gly269Ser). Este gen codifica para una proteína implicada en el transporte de proteínas desde el citosol hacia el interior de la mitocondria. Los estudios realizados en fibroblastos del paciente y en un modelo celular generado mediante CRISPR/Cas9 han demostrado que la deficiencia de TIMM50 da lugar a una disfunción mitocondrial severa que afecta al mantenimiento de la morfología mitocondrial, al ensamblaje del sistema OXPHOS y a la capacidad respiratoria mitocondrial. En el segundo trabajo se ha estudiado un paciente con sospecha de enfermedad mitocondrial que presentaba atrofia cerebral, retraso psicomotor y aciduria 3-MG. Sin embargo, mediante NGS se identificó una mutación en homocigosis en el gen HACE1 (c.240C>A; p.Cys80Ter), que codifica una proteína citoplasmática con actividad ubiquitin-ligasa. Los estudios funcionales realizados han demostrado que la deficiencia de HACE1 da lugar a alteraciones en las vías de respuesta a estrés oxidativo mediadas por NRF2 y defectos en los procesos de autofagia y mitofagia. Además, nuestros resultados han asociado por primera vez, la deficiencia de HACE1 a alteraciones de la función mitocondrial y a aciduria 3-MG. En los dos últimos artículos de la tesis se caracterizan 2 familias con deficiencia del complejo I de la CRM. En la primera, los dos hermanos afectos presentaron encefalopatía, dismorfia, acidosis láctica y aciduria 3-MG desde el nacimiento. Fueron exitus a los pocos meses de vida. Mediante los estudios genéticos, se identificaron mutaciones en homocigosis en el gen NDUFAF4 (c.478G>T; p.Glu160Ter), que codifica un factor de ensamblaje del complejo I de la CRM. Los estudios funcionales demostraron una reducción drástica del ensamblaje del complejo I y de los supercomplejos de alto peso molecular, alteraciones en la morfología mitocondrial y deficiencia de la respiración mitocondrial. En la segunda familia, se identificaron mutaciones en homocigosis en el gen NDUFA8 (c.293G>T; p.Arg98Leu), que codifica una subunidad del complejo I. La particularidad de estos pacientes reside en la progresión sorprendentemente favorable de la enfermedad, siendo prácticamente asintomáticos a la edad de 6 y 9 años. Este fenotipo es atípico tratándose de una deficiencia del complejo I de la CRM. Sin embargo, los estudios funcionales mostraron una importante deficiencia en el ensamblaje del complejo I y de los supercomplejos. La patogenicidad de la mutación fue demostrada mediante estudios de complementación funcional en fibroblastos de los pacientes. En resumen, los estudios funcionales realizados han permitido confirmar que las variantes identificadas son la causa de la enfermedad y profundizar en el conocimiento de las bases moleculares de estas enfermedades