Computational approaches for parameterization of aminoacyl-tRNA synthetase substrates

Aim. To parameterize a modified chained residue and use a newborn topology for molecular dynamics simulation. Methods. To deal with the problem, a series of ab initio and semi-empirical methods were combined. The RESP (Restrained ElectroStatic Potential) program, which fits molecular electrostatic potential (MEP) at molecular surfaces using an atom-centered point charge model. All parameters were quantum mechanically calculated and processed with R.E.D.III server. Results. The method of molecular dynamics has potential advantages, like its capability to explore large systems, and disadvantages, like not being feasible to run on fly without a preliminary prepared topologies for identification of each molecule. In an attempt to find a balance between both features speed and accuracy and apply the approach in a computational study, a functional mechanism of prolyl-tRNA synthetase from E. faecalis was investigated. In addition, a well validated protocol of topology preparation for non-canonical structure was developed. Conclusions. Computational approaches like molecular dynamics simulation and molecular docking had now become a strong in silico methods to study biological processes. The major benefits of this methods are expensiveness and speed. It also a strong competitor of quantum modeling approach. However, there is a need to include new structures that are not exist in the GROMACS library is associated with the growing use of different types of modified amino and nucleic acids (DNA derivatives and RNAs) both in fundamental studies in molecular biology, molecular biophysics, etc., and in applied research related to the search for new drugs. The obtained data well correlate with the experimental data.Мета. Параметризувати модифікований залишок в ланцюзi і використати отриману топологію для моделювання методом молекулярної динаміки. Методи. Для вирішення цієї проблеми була проведена серія ab initio і напівемпіричних розрахунків для отримання молекулярного електростатичного потенціалу (MEP). Програма для розрахунку RESP (Restrained ElectroStatic Potential), яка застосовує отриманий розподіл MEP на молекулярні поверхні iз використанням атомно-центрованої моделі точкових зарядів. Всі параметри були квантово-механічно розраховані і оброблені сервером R.E.D.III. Результати. Метод молекулярної динаміки має потенційні переваги, такі як можливість вивчати великі системи, і недоліки, такі як неможливість запуску без попередньо підготовленої топології для кожної молекули. У спробі знайти баланс між обома властивостями методу, швидкістю і точністю, та застосувати підхід в обчислювальному дослідженні була використана система для вивчення функціонального механізму пролiл-тРНК-синтетази у E. faecalis. Крім того, був розроблений добре перевірений протокол підготовки топології для неканонічних структур. Висновки. Обчислювальні підходи, такі як моделювання методом молекулярної динаміки, є помiтним конкурентом квантового моделювання. Тим не менш, необхiднiсть включення нових структур, які не входять у бібліотеку GROMACS, пов'язана з неточнiстю в описi структурних параметрів. Прикладом такої ситуації є зростанюче використання різних типів модифікованих амінокислот та нуклеїнових кислот (похідні ДНК та РНК). Правильна параметризація молекул має вирішальне значення для фундаментальних досліджень з молекулярної біології, молекулярної біофізики тощо та інтерпретації обчислювальних досліджень, пов'язаних iз пошуком нових лікарських засобів. У роботі описується метод підготовки вхідних даних на прикладi системи проліл-тРНК-синтетази та є посилання на попередні роботи, в яких отримані результати добре співвідносяться iз експериментальними даними.Цель. Параметризовать модифицированный остаток цепи и использовать полученную топологию для моделирования методом молекулярной динамики. Методы. Для решения этой проблемы была произведена серия ab initio и полуэмпирических расчетов для получения молекулярного электростатического потенциала (MEP). Программа для расчета RESP (Restrained ElectroStatic Potential), которая применяет полученное распределение MEP на молекулярные поверхности с использованием атомно-центрированной модели точечных зарядов. Все параметры были квантово-механически рассчитаны и обработаны сервером R.E.D.III. Результаты. Метод молекулярной динамики имеет потенциальные преимущества, такие как возможность изучать большие системы, и недостатки, такие как невозможность запуска без предварительно подготовленной топологии для каждой молекулы. В попытке найти баланс между обоими свойствами метода, скоростью и точностью, и применить подход в вычислительном исследовании была использована система для изучения функционального механизма пролил-тРНК-синтетазы у E.faecalis. Кроме того, был разработан хорошо проверенный протокол подготовки топологии для неканонических структур. Выводы. Вычислительные подходы, такие как моделирование молекулярной динамики и молекулярный докинг, превратились в мощные in silico методы изучения биологических процессов. Основными преимуществами этих методов являются низкие системные требования и скорость. Подобные рассчеты являются конкурентами для квантового моделирования. Тем не менее, необходимость включать новые структуры, которых нет в библиотеке программ, связана с растущим использованием различных типов модифицированных аминокислот и нуклеиновых кислот (производных ДНК и РНК) как в фундаментальных исследованиях в области молекулярной биологии, молекулярной биофизики, и т. д., так и в прикладных исследованиях, связанных с поиском новых лекарств. В нашем случае, полученные данные хорошо коррелируют с экспериментальными данными

Gingival Recession Treatment with the Use of Xenogeneic Matrix: Optimization of Patient-Centered Outcomes by the Digital Soft Tissue Design

Objective: To evaluate the impact of the originally-developed approach aimed at pre-treatment graphical modelling of soft-tissue changes (digital soft tissue design) for the optimization of patient-centered outcomes after Class I and Class II single gingival recessions treatment with the use of a xenogeneic dermal matrix. Material and Methods: Patients enrolled in the study group received single gingival recession treatment via CAF+XDM method supported by pre-treatment graphical modelling of potential soft-tissue changes (digital soft tissue design), while patients enrolled in the control group received single gingival recession treatment via CAF+CTG method with no pre-treatment graphical modeling of gingival level changes. Patient-centered outcomes were measured by visual analogue scale, OHIP-14, and Mahajan’s scales. Results: Realization of pre-treatment graphical modelling of soft-tissue changes supported the achievement of better patient-centered outcomes, such as root coverage (p<0.05), surgical phase (p<0.05), post-surgical phase (p<0.05), cost-effectiveness (p<0.05) and diagnostics and patient-orientation (p<0.05) based on patient's personal perception grades. Conclusion: Patient-centered results were found to be more successful within the group using the xenogeneic type of graft accompanied with the implementation of pre-treatment graphical modeling of soft tissue changes, which helped to balance patients’ pre-operative expectations and post-operative satisfaction with the received results, reduce post-operative morbidity and improve oral health-related quality of life

Prolyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus is eukaryotic-like but aminoacylates prokaryotic tRNAPro

Aim. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding prolyl-tRNA synthetase, a class IIa enzyme, from the extreme thermophile T. thermophilus HB8 (ProRSTT). Methods. Search for the ProRSTT gene was performed by Southern blot hybridization with chromosomal DNA, the digoxigenin-labeled PCR fragments of DNA being used as a probe. Results. The gene of T. thermophilus HB8 ProRS has been cloned and sequenced. The predicted 477-amino acid protein is significantly more similar in sequence to eukaryotic and archaeal than to eubacterial ProRS. Sequence analysis shows two distinct structural groups of ProRS which most likely had diverged early in evolution: (1) eukaryotic/archaeal group characterized by the absence of an insertion domain between motifs 2 and 3 and by the presence of an extra C-terminal domain beyond the normal class IIa anticodon binding domain; and (2) prokaryotic with a very large insertion between motif 2 and 3 and no extra C-terminal domain. Conclusions. T. thermophilus proS gene was overexpressed in Escherichia coli and overproduced ProRSTT was purified to high homogeneity. In spite of its eukaryotic-like features, T. thermophilus ProRS exhibited highly specific cross-species aminoacylation. The charging ability of the ProRSTT is restricted to prokaryotic tRNAPro. Keywords: prolyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus, proS gene, сloning, sequencing, expression.Мета. Клонування, секвенування та експресія гена проліл-тРНК синтетази, ферменту IIa класу, з бактерії екстремального термофіла T. thermophilus HB8 (ProRSTT). Методи. Пошук гена Pro RSTT проводили методом Са у зерн-блот-гібридизації з хромосомної ДНК, де як зонди використано мічені дигоксигеніном ПЛРфрагменти ДНК. Результати. Ген ProRSTT HB8 клоновано і секвеновано. Відкрита рамка зчитування гена кодує білок довжиною 477 аміно кислотних залишків, який має більшу гомологію з еукаріотичними і архейними, ніж з бактерійними ProRSs. Дані філогенетичного аналізу засвідчують, що існують дві різні структурні групи ProRS, які розійшлися на початку еволюції: 1) еукаріотично/архейний тип, що характеризується відсутністю вставки в області між мотивами 2 і 3 та наявністю додаткового C-кінцевого домену до звичайного для класу IIa антикодон-зв’язувального домену та 2) про каріотичний тип – з дуже великими вставками між мотивами 2 і 3 та без додаткового C-кінцевого домену. Висновки. З використанням експресуючого вектора ProRSTT суперпродуковано в клітинах Escherichia coli і термостабільний фермент очищено до високого ступеня гомогенності. Незважаючи на приналежність до еукаріотичного типу, ProRSTT показала здатність з високою специфічністю аміноацилювати бактерійну тРНК, у той час як активність відносно тРНК еукаріотів виявилася вкрай низькою. Ключові слова: проліл-тРНК синтетаза з Thermus thermophilus, ген proS, клонування, секвенування, експресія.Цель. Клонирование, секвенирование и экспрессия гена пролил-тРНК синтетазы, фермента IIa класса, из бактерии экстремального термофила T. thermophilus HB8 (ProRSTT). Методы. Поиск гена ProRSTT проведен методом Саузерн-блот гибридизации с хромосомной ДНК, где в качестве зондов использованы меченные дигоксигенином ПЦР-фрагменты ДНК. Результаты. Ген ProRSTT HB8 был клонирован и секвенирован. Открытая рамка считывания гена кодирует белок длиной 477 аминокислотных остатков, который имеет большую гомологию с эукариотическими и архейными, чем бактериальными ProRSs. Данные филогенетического анализа показывают, что существуют две различные структурные группы ProRS, которые разошлись в начале эволюции: 1) эукариотического/архейного типа, характеризующиеся отсутствием вставки в области между мотивами 2 и 3 и наличием дополнительного C-концевого домена к обычному для IIa класса антикодон связывающему домену и 2) прокариотического типа – с очень большими вставками между мотивами 2 и 3 и без дополнительного C-концевого домена. Выводы. С использованием экспресирующего вектора ProRSTT суперпродуцирована в клетках Escherichia coli и термостабильный фермент очищен до высокой степени гомогенности. Несмотря на свою принадлежность к эукариотическому типу, ProRSTT выявила способность аминоацилировать с высокой специфичностью бактериальную тРНК, в то время как активность по отношению к тРНК эукариотов оказалась крайне низкой. Ключевые слова: пролил-тРНК синтетаза из Thermus thermophilus, ген proS, клонирование, секвенирование, экспрессия

The structural basis for seryl-adenylate and Ap4A synthesis by seryl-tRNA synthetase

AbstractBackground: Seryl-tRNA synthetase is a homodimeric class II aminoacyl-tRNA synthetase that specifically charges cognate tRNAs with serine. In the first step of this two-step reaction, Mg·ATP and serine react to form the activated intermediate, seryl-adenylate. The serine is subsequently transferred to the 3′-end of the tRNA. In common with most other aminoacyl-tRNA synthetases, seryl-tRNA synthetase is capable of synthesizing diadenosine tetraphosphate (Ap4A) from the enzyme-bound adenylate intermediate and a second molecule of ATP. Understanding the structural basis for the substrate specificity and the catalytic mechanism of aminoacyl-tRNA synthetases is of considerable general interest because of the fundamental importance of these enzymes to protein biosynthesis in all living cells.Results Crystal structures of three complexes of seryl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus are described. The first complex is of the enzyme with ATP and Mn2+. The ATP is found in an unusual bent conformation, stabilized by interactions with conserved arginines and three manganese ions. The second complex contains seryl-adenylate in the active site, enzymatically produced in the crystal after soaking with ATP, serine and Mn2+. The third complex is between the enzyme, Ap4A and Mn2+. All three structures exhibit a common Mn2+ site in which the cation is coordinated by two active-site residues in addition to the α-phosphate group from the bound ligands.Conclusion Superposition of these structures allows a common reaction mechanism for seryl-adenylate and Ap4A formation to be proposed. The bent conformation of the ATP and the position of the serine are consistent with nucleophilic attack of the serine carboxyl group on the α-phosphate by an in-line displacement mechanism leading to the release of the inorganic pyrophosphate. A second ATP molecule can bind with its γ-phosphate group in the same position as the β-phosphate of the original ATP. This can attack the seryl-adenylate with the formation of Ap4A by an identical in-line mechanism in the reverse direction. The divalent cation is essential for both reactions and may be directly involved in stabilizing the transition state

Cloning, expression and purification of D-Tyr-tRNATyr-deacylase from Thermus thermophilus

D-Tyr-tRNATyr-deacylase (DTD) is a conservative enzyme, found in all domains of life, which ensures an additional checkpoint in the recycling of misaminoacylated D-Tyr-tRNATyr. DTD is capable of accelerating the hydrolysis of the ester linkage of D-Tyr-tRNATyr producing a free tRNA and D-tyrosine, thereby preventing an incorrect incorporation of D-amino acids into proteins. Deacylase distinguishes between D- and L-aminoacyl moieties and does not hydrolyze L-aminoacylated tRNA. The structural bases of this specificity and the mechanism of D-aminoacyl-tRNA hydrolysis are poorly understood. Aim. To clone D-Tyr-tRNATyr-deacylase from T. thermophilus (DTDTT), optimize the conditions for its expression in E.coli and develop an efficient purification procedure yielding the high quality enzyme suitable for the structural and functional studies. Methods. For amplification of DTD gene from T. thermophilus genomic DNA and its cloning into the pProEXHTb expression vector modern techniques were applied. Purification of the recombinant DTD protein was done with three types of column chromatography. His-tag was cleaved out from DTD by TEV protease. The cleavage was confirmed by Western blot analysis with anti-His-tag antibodies. Molecular weight of purified DTDTT was determined by the gel-filtration. Results. The expression construct pProEXHTb, containing DTD sequence from T. thermophilus, was obtained and successfully expressed in the BL21(DE3)pLysS E.coli strain. The protein of interest was purified to homogeneity by the combination of affinity (Ni-NTA), anion-exchange (Q-Sepharose) and size-exclusion (Superdex S 200) chromatographies. 2 mg of more than 90% pure recombinant DTD can be obtained from 1 L of bacterial culture. Molecular weight of purified DTD from T. thermophilus was determined to be 32 kDa, suggesting its dimeric structure. Conclusions. The pProEXHTb expression vector can be used for expression of DTD from T. thermophilus. The preparative amounts of DTD can be obtained after the three-step chromatographic procedures and used for further functional and structural studies.D-Тир-тРНКТир-деацилаза (DTD) є консервативним білком, знайденим у всіх царствах живої природи, що забезпечує додатковий корегувальний етап гідролізу помилково аміноацильованих субстратів D-Тир-тРНКТир DTD здатна приcкорювати гідроліз ефірного зв’язку в комплексі D-Тир-тРНКТир, утворюючи вільну тРНК та D-Тир, таким чином попереджуючи включення D-амінокислот до білків. Деацилаза розрізняє D- та L-аміноацильні залишки в аміноацильованій тРНК та не гідролізує останні. Структурні основи такої специфічності та механізм гідролізу D-аміноацил-тРНК за участі DTD є недостатньо зрозумілими. Мета. Клонувати D-Тир-тРНКТир-деацилазу з T. the­rmophilus (DTDTT), оптимізувати умов її експресії в E. coli, розробити ефективний метод очищення з високим виходом високоякісного ферменту, для структурних та функціональних досліджень. Методи. Ампліфікацію та клонування в pProEXHTb DTD гена геномної ДНК T. ther­mo­philus проведено за стандартними молекулярно-біологічними методами. Очистку рекомбінантного DTD білка проводено хроматографічно. Залишки гістидину відщеплено від DTD протеазою вірусу тютюну (TEV), ефективність реакції перевірено Вестерн-блот аналізом з анти-His-антитілами. Молекулярну масу очищеної DTDTT визначено гель-фільтрацією. Результати. Отримана конструкція pProEXHTb, що містить DTD послідовність з T. thermophilus, експресовано в E.coli штаму BL21(DE3)pLysS. Цільовий рекомбінантний білок виділено і очищено комбінацєю хроматографій: афінної (Ni-NTA), аніон-обмінної (Q-Sepharose) та гель-фільтрації (Superdex S 200) до чистоти 90%. Вихід рекомбінантної DTD склав 2 мг з одного літру культури. Визначена молекулярна маса очищеної DTD з T. thermophilus – 32 кДа свідчить на користь її димерної структури. Висновки. Отриманий вектор pProEXHTb, що містить DTD з T. thermophilus і підібрані умови очистки дозволяють отримати рекомбінантний DTD в кількостях достатніх для подальших структурно-функціональних досліджень.D-Тир-тРНКТир-деацилаза (DTD) является консервативным белком, найденным во всех царствах живой природы, обеспечивающим дополнительный корректирующий этап гидролиза ошибочно аминоацилированных субстратов D-Тир-тРНКТир. DTD ускоряет гидролиз эфирной связи в комплексе D-Тир-тРНКТир, предупреждая, таким образом, ошибочное включение D-аминокислот в белки. Деацилаза различает D- и L-аминоацильные остатки в аминоацилированной тРНК и не гидролизирует последние. Структурные основы такой специфичности и механизм гидролиза D-аминоацил-тРНК при участии DTD являются недостаточно изученными. Цель. Клонировать D-Тир-тРНКТир-деацилазу из T. thermophilus (DTDTT), оптимизировать условия её экспрессии в E. coli и разработать эффективный, с высоким выходом высококачественного фермента, метод очистки. Методы. Для амплификации и клонирования в pProEXHTb гена DTD геномной ДНК T. thermophilus использованы стандартные молекулярно-биологические методы. Очистку рекомбинантного DTD белка проводили хроматографически. Остатки гистидина отщепили протеазой вируса табака (TEV), еффективность реакции проверили Вестерн-блот анализом с анти-His-антителами. Молекулярный вес очищенной DTDTT определили гель-фильтрацией. Результаты. Полученная конструкция pProEXHTb, содержащая DTD последовательность T. thermophilus, экспрессирована в клетках E. coli штамма BL21(DE3)pLysS. Последовательными хроматографиями: афинной (Ni-NTA), анион-обменной (Q-Sepharose) и гель-фильтрации (Superdex S 200) получен гомогенный белок с чистотой более 90 %. Разработанная методика позволяет получить до 2 мг целевого белка / 1 л культуры. Определенный молекулярный вес очищенной DTD из T. thermophilus – 32 кДа свидетельствует о ее димерной структуре. Выводы. Полученная конструкция pProEXHTb, содержаащя DTD последовательность T. thermophilus и подобранные условия очистки позволяют получить рекомбинантный DTD для дальнейших структурно-функциональных исследований

Molecular cloning, sequencing and sequence analysis of Thermus thermophilus tyrosyl-tRNA synthetase

The gene encoding tyrosyl-tRNA synthetase (TyrRS) from the extreme thermophilic eubacterium T. thermophilus HB27 has been cloned and sequenced. The open reading frame encodes a polypeptide chain of 432 amino acid residues in length (molecular mass 48717 Da). Comparison of the amino acid sequence of the T. thermophilus TyrRS (TyrRSTT) with those of TyrRS from various organisms shows that T. thermophilus enzyme shares a branch in the philogenetic tree of eubacterial TyrRSs with the enzymes from Aquifex aeolicus, Deinococcus radiodurans, Haemophilus influenzae and Helicobacter pyroly (40-57 % amino acid identity), distinct from the branch containing Esherichia coli, Chlamydia trachomatis and Bacillus stearothermophilus, for example (24–28 % amino acid identity). The TyrRS active site domain is highly conserved, whereas a C-terminal tRNA binding domain contains only few conserved residues. But even in the active site exists one very important difference between the two groups of bacterial TyrRSs: Lys-41 in TyrRSTT (and in TyrRS from many human pathogenic bacteria) is conserved as a tyrosine in another group of bacterial TyrRSs and eukaryotic sequences including human. This knowledge could be exploited in the design of new antibiotics.Клоновано та визначено нуклеотидну послідовність гена, що кодує тирозил-тРНК синтетазу (TyrRS) із екстремальнотермофільної еубактеріХ Т. thermophilus НВ27 (TyrRSTT). Відкрита рамка зчитування кодує поліпептидний ланцюг до­вжиною 432 амінокислотних залишки (молекулярна маса 48717 Да). Порівняння амінокислотної послідовності TyrRSTT з відповідними послідовностями інших організмів виявило, що фермент із Т. thermophilus належить до тієї ж гілки філо­генетичного дерева еубактеріальних TyrRS, що й ферменти із Aquifex aeolicus, Deinococcus radiodurans, Haemophilus influenzae і Helicobacter pyroly (ідентичність 40–57 %), але не до тієї, до якої належать, наприклад, Escherichia coli, Chlamydia tracho­matis і Bacillus stearothermophilus (24–28 % ідентичності). Амінокислотна послідовність каталітичного домену висококонсервативна, тоді як тРНК-зв'язувальний С-кінцевий домен містить лише невелику кількість консервативних залишків. Але навіть в активному центрі існує важлива відмінність між двома групами еубактеріальних TyrRS: залишок Lys-41 в TyrRSTT (і в TyrRS із багатьох патогенних бактерій людини) представлений консервативним залишком тирозину в бак­теріальних TyrRS іншої групи, а також еукаріотичних TyrRS, включаючи людину. Ця відмінність може бути використана при створенні нових антибіотиків.Клонирован ген, кодирующий тирозил-тРНК синтетазу (TyrRS) из экстремально термофильной эубактерии Т. ther­mophilus НВ27 (TyrRSTT), и определена его нуклеотидная последовательность. Открытая рамка считывания кодирует полипептидную цепь длиной 432 аминокислотных остатка (молекулярная масса 448717 Да). Сравнение аминокислотных последовательностей TyrRSTT с соответствующими последвательностями из других организмов выявило, что фермент из Т. thermophilus относится к той же ветви филогенетиче­ского древа эубактериальных TyrRS, что и ферменты из Aquifex aeolicus, Deinococcus radiodurans, Haemophilus influenzae и Helicobacter pyroly (идентичность 40–57 %), но не к той, к которой принадлежат, например, Escherichia coli, Chlamydia trachomatis и Bacillus stearothermophilus (24–28 % идентично­сти). Аминокислотная последовательность каталитического домена высококонсервативна, в то время как тРНК-связывающий С-концевой домен содержит лишь несколько консерва­тивных остатков. Однако даже в последовательности актив­ного центра отмечено важное различие между двумя группами эубактериальных TyrRS: остаток Lys-41 в TyrRSTT (и в TyrRS из многих патогенных бактерий человека) представлен консервативным остатком тирозина в бактериальных TyrRS другой группы, а также в TyrRS эукариот, включая человека Это отличие может быть использовано при создании новых антибиотиков

Recognition of tRNAs with a long variable arm by aminoacyl-tRNA synthetases

In prokaryotic cells three tRNA species, tRNASer, tRNALeu and tRNATyr, possess a long variable arm of 11–20 nucleotides (type 2 tRNA) rather than usual 4 or 5 nucleotides (type 1 tRNA). In this review we have summarized the results of our research on the structural basis for recognition and discrimination of type 2 tRNAs by Thermus thermophilus seryl-, tyrosyl- and leucyl-tRNA synthetases (SerRS, TyrRS and LeuRS) obtained by X-ray crystallography and chemical probing tRNA in solution. Crystal structures are now known of all three aminoacyl-tRNA synthetases complexed with type 2 tRNAs and the different modes of tRNA recognition represented by these structures will be discussed. In particular, emphasis will be given to the results on recognition of characteristic shape of type 2 tRNAs by cognate synthetases. In tRNASer, tRNATyr and tRNALeu the orientation of the long variable arm with respect to the body of the tRNA is different and is controlled by different packing of the core. In the case of SerRS the N-terminal domain and in the case of TyrRS, the C-terminal domain, bind to the characteristic long variable arm of the cognate RNA, thus recognizing the unique shape of the tRNA. The core of T. thermophilus tRNALeu has several layers of unusual base-pairs, which are revealed by the crystal structure of tRNALeu complexed with T. thermophilus LeuRS and by probing a ligand-free tRNA by specific chemical reagents in solution. In the crystal structure of the LeuRS-tRNALeu complex the unique D-stem structure is recognized by the C-terminal domain of LeuRS and these data are in good agreement with those obtained in solution. LeuRS has canonical class I mode of tRNA recognition, approaching the tRNA acceptor stem from the D-stem and minor groove of the acceptor stem side. SerRS also has canonical class II mode of tRNA recognition and approaches tRNASer from opposite, variable stem and major groove of acceptor stem site. And finally, TyrRS in strong contrast to canonical class I system has class II mode of tRNA recognition.У клітинах евкаріотів тРНК трьох специфічностей – тРНКSer, тРНКLeu і тРНКTyr – мають довгу варіабельну гілку довжиною 11–20 нуклеотидів (2-га група тРНК) на відміну від чотирьох або п’яти нуклеотидів 1-ї групи тРНК. Підсумовано результати наших досліджень структурних основ упізнавання і дискримінації тРНК 2-ї групи серил-, тирозил- і лейцил-тРНК синтетазами з Thermus thermophilus (СерРС, ТирРС і ЛейРС), отриманих методами рентгенівської кристалографії і хімічної модифікації тРНК у розчині. На сьогодні кристалічна структура відома для всіх трьох комплексів аміноацил-тРНК синтетаз з відповідними тРНК 2-ї групи, різні типи впізнавання яких обговорюються в огляді. Зокрема, особливу увагу приділено результатам аналізу впізнавання гомологічними синтетазами характерних рис просторової структури тРНК 2-ї групи. У тРНКSer, тРНКLeu і тРНКTyr орієнтація довгої варіабельної гілки відносно основного тіла тРНК відрізняється і контролюється різною упаковкою корової частини молекули. У разі СерРС N-кінцевий, а в разі ТирРС – C-кінцевий домени зв’язуються з певними структурами довгих варіабельних гілок гомологічних РНК, упізнаючи таким чином унікальну структурну форму тРНК. Корова частина тРНКLeu має кілька шарів незвичайних пар основ, виявлених при вивченні кристалографічної структури комплексу тРНКLeu з ЛейРС із T. thermophilus та при дослідженні вільної тРНК у розчині методом хімічної модифікації з використанням специфічних реагентів. У кристалографічній структурі комплексу ЛейРС-тРНКLeu унікальна будова D-стебла впізнається С-кінцевим доменом ЛейРС і ці дані добре узгоджуються з результатами, отриманими в розчині. ЛейРС притаманний канонічний для синтетаз І структурного класу тип упізнавання тРНК – з боку D-стебла і малої борозенки акцепторного стебла. Для СерРС також характерний канонічний для синтетаз ІІ структурного класу тип упізнавання тРНК – з протилежного боку, тобто з боку варіабельного стебла і великої борозенки акцепторного стебла. І, нарешті, ТирРС на відміну від канонічного для ферментів І класу типу має тип упізнавання тРНК, властивий синтетазам ІІ класу.В клетках эукариотов тРНК трех специфичностей – тРНКSer, тРНКLeu и тРНКTyr – имеют длинную вариабельную ветку длиной 11–20 нуклеотидов (2-я группа тРНК) в отличие от четырех или пяти нуклеотидов 1-й группы тРНК. Суммированы результаты наших исследований структурных основ узнавания и дискриминации тРНК 2-й группы серил-, тирозил- и лейцил-тРНК синтетазами из Thermus thermophilus (СерРС, ТирРС и ЛейРС), полученные методами рентгеновской кристаллографии и химической модификации тРНК в растворе. На сегодня кристаллическая структура известна для всех трех комплексов аминоацил-тРНК синтетаз с соответствующими тРНК 2-й группы, разные типы узнавания которых обсуждаются в обзоре. В частности, особенное внимание уделено результатам анализа узнавания гомологичными синтетазами характерных черт пространственной структуры тРНК 2-й группы. У тРНКSer, тРНКLeu и тРНКTyr ориентация длинной вариабельной ветви относительно основного тела тРНК отличается и контролируется разной упаковкой коровой части молекулы. В случае СерРС N-концевой, а в случае ТирРС – C-концевой домены связываются с определенными структурами длинных вариабельных веток гомологичных РНК, узнавая тем самым уникальную структурную форму тРНК. Коровая часть тРНКLeu имеет несколько слоев необычных пар оснований, выявленных при изучении кристаллографической структуры комплекса тРНКLeu с ЛейРС из T. thermophilus и при исследовании свободной тРНК в растворе методом химической модификации с использованием специфических реагентов. В кристаллографической структуре комплекса ЛейРС–тРНКLeu уникальное строение D-стебля узнается С-концевым доменом ЛейРС и эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными в растворе. ЛейРС свойствен канонический для синтетаз І структурного класса тип узнавания тРНК – со стороны D-стебля и малой бороздки акцепторного стебля. Для СерРС также характерный канонический для синтетаз ІІ структурного класса тип узнавания тРНК – с противоположной стороны, т. е. со стороны вариабельного стебля и большой бороздки акцепторного стебля. И, наконец, ТирРС в отличие от канонического для ферментов І класса типа имеет тип узнавания тРНК, присущий синтетазам ІІ класса

Leucyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus. Purification and some properties of the crystallizing enzyme

Leucyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus (LeuRSTT) was purified to homogeneity using a five-step purification procedure. The enzyme was characterized and crystallized. Molecular mass determinations of the native and denatured proteins indicate monomeric structure of LeuRSTT with the molecular mass of about 101 kDa. The protein obtained is remarkably thermostable and retains 97 % of its initial aminoacylation activity after 1 hour of incubation at 88 °C. Crystals of LeuRSTT were obtained from ammonium sulfate solution by the vapour diffusion techniques. The crystals quality was improved by crystallization from the precipitate.Лейцил-тРНК синтетаза из Thermus thermophilus (ЛейРСТТ) выделена в гомогенном состоянии с использованием пяти стадий очистки. Фермент охарактеризован и получены его кристаллы. Определена молекулярная масса нашивного и дена­турированного белка. Установлено, что ЛейРСТТ представ­ляет собой мономер с молекулярной массой 101 кДа. Получен­ный фермент обладает значительной термостабильностью и сохраняет 97 % аминоацилирующей активности после инкуба­ции в течение 1 ч при температуре 88 °С. Кристаллы ЛейРСТТ получены методом диффузии паров с использованием в качестве осадителя раствора сульфата аммонияЛейцил-тРНК синтетазу із Thermus thermophilus (ЛейРСТТ) виділено в гомогенному стані з використанням п'яти стадій очищення. Фермент охарактеризовано та отримано його кристали. Визначено молекулярну масу нативного і денатуро­ваного білка. Встановлено, що ЛейРСТТ являє собою мономер з молекулярною масою 101 кДа. Отриманому ферментові притаманна значна термостабільність і він зберігає 97 % аміноацилюючої активності після інкубації протягом 1 год при температурі 88 ° С Кристали ЛейРСТТ одержано методом дифузії парів із використанням як осаджувана розчину сульфату амонію

Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27

Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermophilus (HB 27 strain) was amplified by PCR and cloned into vectors with and without a histidine tag. To optimize conditions for the protein expression in E. coli and to develop efficient purification procedure, the molecular biology techniques were applied. AlaRS was purified by affinity and size-exclusion chromatography. The molecular weight of enzyme was determined by gel filtration. Results. The expression and purification conditions for recombinant AlaRS were optimized. Approximately 1.5 mg of the pure active recombinant enzyme can be obtained from 1 L of bacterial culture. AlaRS from T. thermophilus is a dimer in solution with an experimental MW of 204 kDa. Conclusions. The purified recombinant enzyme will be used for further studies on the functional kinetics and structure of the crystal complex with tRNA.Мета. Для детального вивчення структурних та функціональних властивостей аланіл-тРНК-синтетази (АлаРС) було створено генно-інженерну конструкцію для експресії та очищення повнорозмірної синтетази та перевірено її активність у реакції аміноацилювання. Методи. Ген AlaS з T. thermophilus (штам HB27) геномної ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР з відповідними праймерами та клонували у вектор з та без гістидинової послідовності. Для оптимізації умов експресії білка в E.coli та розробки ефективної процедури очищення були застосовані сучасні методи молекулярної біології. AлаРС очищали методами афінної хроматографії та гель-фільтрації. Молекулярна маса ферменту визначалася на гель-фільтраційній колонці. Результати. Умови експресії та очистки рекомбінантної АлаРС були оптимізовані. Близько 1,5 мг чистого рекомбінантного активного ферменту можна одержати з 1 л бактеріальної культури. АлаРС з T. thermophilus є димером у розчині з експериментальною масою 204 кДа. Висновки. Отриманий рекомбінантний фермент буде використовуватися для подальших експериментів з функціональної кінетики та структурних досліджень кристалічного комплексу з тРНК.Цель. Для детального изучения структурных и функциональных свойств аланил-тРНК-синтетазы (АлаРС) было создано генно-инженерную конструкцию для экспрессии и очистки полноразмерной синтетазы и проверено ее активность в реакции аминоацилирования. Методы. Ген аlaS из геномной ДНК T. thermophilus (штамм HB27) амплифицировали с помощью ПЦР с соответствующими праймерами и клонировали в вектор с и без гистидиновой последовательностью. Для оптимизации условий экспрессии белка в E. coli и разработки эффективной процедуры очистки были применены современные методы молекулярной биологии. AлаРС очищали методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Молекулярная масса фермента определялась на гель-фильтрационной колонке. Результаты. Условия экспрессии и очистки рекомбинантной АлаРС были оптимизированы. Около 1,5 мг чистого рекомбинантного активного фермента можно получить с 1 л бактериальной культуры. АлаРС с T. thermophilus является димером в растворе с экспериментальной массой 204 кДа. Выводы. Полученный рекомбинантный фермент будет использован для дальнейших экспериментов с функциональной кинетики и структурных исследований кристаллического комплекса с тРН

Recognition of tRNALeu by Aquifex aeolicus leucyl-tRNA synthetase during the aminoacylation and editing steps

Recognition of tRNA by the cognate aminoacyl-tRNA synthetase during translation is crucial to ensure the correct expression of the genetic code. To understand tRNALeu recognition sets and their evolution, the recognition of tRNALeu by the leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) from the primitive hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus was studied by RNA probing and mutagenesis. The results show that the base A73; the core structure of tRNA formed by the tertiary interactions U8–A14, G18–U55 and G19–C56; and the orientation of the variable arm are critical elements for tRNALeu aminoacylation. Although dispensable for aminoacylation, the anticodon arm carries discrete editing determinants that are required for stabilizing the conformation of the post-transfer editing state and for promoting translocation of the tRNA acceptor arm from the synthetic to the editing site