CRISPR-delivery particles targeting nuclear receptor-interacting protein 1 (Nrip1) in adipose cells to enhance energy expenditure

RNA-guided, engineered nucleases derived from the prokaryotic adaptive immune system CRISPR-Cas represent a powerful platform for gene deletion and editing. When used as a therapeutic approach, direct delivery of Cas9 protein and single-guide RNA (sgRNA) could circumvent the safety issues associated with plasmid delivery and therefore represents an attractive tool for precision genome engineering. Gene deletion or editing in adipose tissue to enhance its energy expenditure, fatty acid oxidation, and secretion of bioactive factors through a browning process presents a potential therapeutic strategy to alleviate metabolic disease. Here, we developed CRISPR-delivery particles, denoted CriPs, composed of nano-size complexes of Cas9 protein and sgRNA that are coated with an amphipathic peptide called Endo-Porter that mediates entry into cells. Efficient CRISPR-Cas9-mediated gene deletion of ectopically expressed GFP by CriPs was achieved in multiple cell types, including a macrophage cell line, primary macrophages, and primary pre-adipocytes. Significant GFP loss was also observed in peritoneal exudate cells with minimum systemic toxicity in GFP-expressing mice following intraperitoneal injection of CriPs containing Gfp-targeting sgRNA. Furthermore, disruption of a nuclear co-repressor of catabolism, the Nrip1 gene, in white adipocytes by CriPs enhanced adipocyte browning with a marked increase of uncoupling protein 1 (UCP1) expression. Of note, the CriP-mediated Nrip1 deletion did not produce detectable off-target effects. We conclude that CriPs offer an effective Cas9 and sgRNA delivery system for ablating targeted gene products in cultured cells and in vivo, providing a potential therapeutic strategy for metabolic disease

CRISPR-enhanced human adipocyte \u27browning\u27 as cell therapy for metabolic disease [preprint]

Obesity and type 2 diabetes (T2D) are associated with poor tissue responses to insulin [1,2], disturbances in glucose and lipid fluxes [3-5] and comorbidities including steatohepatitis [6] and cardiovascular disease [7,8]. Despite extensive efforts at prevention and treatment [9,10], diabetes afflicts over 400 million people worldwide [11]. Whole body metabolism is regulated by adipose tissue depots [12-14], which include both lipid-storing white adipocytes and less abundant \u27brown\u27 and \u27brite/beige\u27 adipocytes that express thermogenic uncoupling protein UCP1 and secrete factors favorable to metabolic health [15-18]. Application of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene editing [19,20] to enhance \u27browning\u27 of white adipose tissue is an attractive therapeutic approach to T2D. However, the problems of cell-selective delivery, immunogenicity of CRISPR reagents and long term stability of the modified adipocytes are formidable. To overcome these issues, we developed methods that deliver complexes of SpyCas9 protein and sgRNA ex vivo to disrupt the thermogenesis suppressor gene NRIP1 [21,22] with near 100% efficiency in human or mouse adipocytes. NRIP1 gene disruption at discrete loci strongly ablated NRIP1 protein and upregulated expression of UCP1 and beneficial secreted factors, while residual Cas9 protein and sgRNA were rapidly degraded. Implantation of the CRISPR-enhanced human or mouse brown-like adipocytes into high fat diet fed mice decreased adiposity and liver triglycerides while enhancing glucose tolerance compared to mice implanted with unmodified adipocytes. These findings advance a therapeutic strategy to improve metabolic homeostasis through CRISPR-based genetic modification of human adipocytes without exposure of the recipient to immunogenic Cas9 or delivery vectors

Γενετική τροποποίηση λιποκυττάρων με σφαιρίδια μεταφοράς CRISPR/Cas9 για ex vivo θεραπευτική προσέγγιση για τον διαβήτη τύπου 2

Obesity and type 2 diabetes (T2D) are related with abnormalities in glucose and lipid homeostasis which is regulated by insulin. They can lead in severe complications including cardiovascular disease and steatohepatitis. Systemic glucose metabolism is controlled by distinct fat depots which include two main types: white adipose tissue and brown adipose tissue. White adipose tissue is composed by white adipocytes, and it stores energy in the form of lipids, whereas brown adipose tissue is composed by the brown adipocytes. These brown fat cells utilize the stored energy to produce heat and abundantly express uncoupling protein 1 (UCP1) and several secreted factors that altogether enhance metabolism. Brown adipose tissue or murine and human brown/beige adipocyte transplantations have been shown to improve glucose tolerance in obese mice. However, the application of such a therapeutic intervention in human has not been possible due to the limited availability of human brown/beige adipocytes. In this work, a large – scale expansion of human progenitor adipocytes from small samples of human adipose tissue has been used. Parallel to murine, in these human progenitor cells, efficient genome engineering with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) – mediated was achieved. The purpose of this gene editing was to disrupt genes that physiologically prevent the conversion of white adipocytes into brown. Therefore, it was hypothesized that knocking out those genes would allow “browning” of the engineered white preadipocytes after differentiation and hence, favor glucose tolerance. Importantly, in order to make this approach translatable for therapy, a novel genome editing approach was developed that allowed to bypass CRISPR components immunogenicity, off – target and off – tissue effects. Particularly, for this project, an ex vivo delivery method of Streptococcus pyogenes Cas9 and guide RNA was developed and optimized to ensure their prompt degradation following the gene editing. For the CRISPR-Cas9 delivery, electroporation was used with editing efficiency close to 100%. After screening multiple candidate genes identified in literature, nuclear repressor interacting protein 1 (Nrip1) showed the most promising results. The NRIP1 knock-out (NRIP1KO) adipocytes demonstrate a brown-like phenotype which includes UCP1 protein and several secreted factors. The engineered adipocytes were further characterized using a variety of tools including gene expression studies of thermogenic genes, genes related to mitochondrial respiration, fatty acid oxidation and secreted factors and oxygen consumption assay. Evaluation of UCP1 protein expression and transcriptome analysis by bulk RNA sequencing were also employed for the phenotypic characterization. Importantly, the CRISPR – enhanced murine and human adipocytes were implanted in recipient mice that were then placed on high – fat diet for the induction of type 2 diabetes. The engineered adipocyte implant recipients were found with lower levels of accumulated fat and triglycerides in the hepatic parenchyma and with improved glucose tolerance compared to age and gendered – matched control mice that received implants with unedited adipocytes. The CRISPR components were only transiently present in the edited cells as demonstrated by degradation of Cas9 protein after editing.These findings demonstrate a therapeutic approach for the improvement of metabolic homeostasis via CRISPR gene editing with human adipocytes bypassing the patient exposure to the immunogenic Cas9 and guide RNA as well as other vehicles for CRISPR-Cas delivery.Η παχυσαρκία και ο διαβήτης τύπου 2 (ΔΤ2) σχετίζονται με διαταραχές στην ομοιόσταση της γλυκόζης και των λιπιδίων η οποία ρυθμίζεται από την ινσουλίνη και προκαλεί σοβαρές επιπλοκές συμπεριλαμβανομένων καρδιαγγειακών νοσημάτων και στεατοηπατίτιδας. Ο συστημικός μεταβολισμός της γλυκόζης ρυθμίζεται από τους διακριτούς λιπώδεις ιστούς (fat depots), στις οποίες συμπεριλαμβάνονται δύο κυρίως τύποι λιπώδους ιστού το λευκό λίπος και το φαιό (ή καφέ) λίπος. Το μεν λευκό λίπος αποτελείται από τα «λευκά» λιποκύτταρα και έχει ρόλο αποθήκευσης της ενέργειας σε μορφή λιπιδίων ενώ το φαιό λίπος αποτελείται από τα «φαιά» και «μπεζ» λιποκύτταρα. Tα κύτταρα αυτά καταναλώνουν την αποθηκευμένη ενέργεια για την παραγωγή θερμότητας και εκφράζουν την πρωτεΐνη αποσύζευξης 1 (UCP1) καθώς και πλήθος εκκρινόμενων παραγόντων που ευνοούν τον μεταβολισμό. Έχει περιγραφή στη βιβλιογραφία ότι η μεταμόσχευση φαιού λιπώδους ιστού ή ποντικίσιων ή αθανατοποιημένων ανθρώπινων φαιών λιποκυττάρων σε παχύσαρκους μύες βελτιώνει την ανοχή στη γλυκόζη. Ωστόσο, η εφαρμογή μιας ανάλογης θεραπευτικής παρέμβασης στον άνθρωπο δεν έχει καταστεί δυνατή καθώς η διαθεσιμότητα των πρωτογενών ανθρώπινων φαιών/μπεζ λιποκυττάρων είναι εξαιρετικά περιορισμένη. Στην παρούσα διατριβή, χρησιμοποίησα μεθόδους πολλαπλασιασμού σε μεγάλη κλίματα ανθρώπινων πρόγονων λιποκυττάρων από εξαιρετικά μικρά δείγματα ανθρώπινου λιπώδους ιστού. Στα ανθρώπινα πρόδρομα λιποκύτταρα, παράλληλα με τα ποντικίσια, εφάρμοσα τροποποίηση του γονιδιώματος με τη χρήση ομαδοποιημένων με τακτά μεσοδιαστήματα σύντομων παλινδρομικών μοτίβων (CRISPR). O στόχος αυτής της γονιδιακής τροποποίησης είναι να απενεργοποιήσει γονίδια που φυσιολογικά παρεμποδίζουν τη μετατροπή των λιποκυττάρων από λευκά σε φαιά. Συνεπώς, η απώλεια της λειτουργικότητας αυτών των γονιδίων αναμένεται να προκαλέσει την μετατροπή των λευκών λιποκυττάρων σε φαιά που είναι ωφέλιμα για τον μεταβολισμό της γλυκόζης. Σημαντικοί δευτερεύοντες στόχοι της στρατηγικής της θεραπείας είναι η παράκαμψη της ανοσογονικότητας των συστατικών CRISPR και της γονιδιακής τροποποίησης σε ανεπιθύμητους ιστούς καθώς και η ελαχιστοποίηση της ανεπιθύμητης τροποποίησης σε περιοχές του γονιδιώματος εκτός των στοχευμένων. Στην παρούσα εργασία, ανέπτυξα και μεγιστοποίησα τη μέθοδο ex vivo μεταφοράς στα κύτταρα – στόχους (λιποκύτταρα) των συμπλεγμάτων στρεπτοκοκκικού Cas9 ενζύμου και στου οδηγού sgRNA, ούτως ώστε να επιτυγχάνεται η ταχύτατη διάσπασή τους αμέσως μετά την τροποποίηση του γονιδίου – στόχο. Για τη μεταφορά των συμπλεγμάτων αυτών, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ηλεκτροδιάτρησης με αποτελεσματικότητα τροποποίησης που πλησιάζει το 100%. Κατόπιν ελέγχου πλήθους υποψηφίων γονιδίων – στόχων που αναφέρονται στη βιβλιογραφία, εντοπίστηκε ως ο πλέον υποσχόμενος στόχος το γονίδιο της πρωτεΐνης 1 που αναγνωρίζει πυρηνικούς υποδοχείς (NRIP1). Τα λιποκύτταρα στα οποία απενεργοποιήθηκε το Nrip1 γονίδιο (NRIP1 Knock-out, NRIP1KO) επάγουν την έκφραση ενός «φαιού» γονιδιακού προφίλ το οποίο συμπεριλαμβάνει την πρωτεΐνη UCP1 και ορισμένους εκκρινόμενους παράγοντες. Στη συνέχεια, χαρακτήρισα in vitro το φαινότυπο των τροποποιημένων κυττάρων με πλήθος δοκιμασιών όπως έκφραση γνωστών γονιδίων που σχετίζονται με τη θερμογένεση, μιτοχονδριακή αναπνοή, οξέωση λιπιδίων, εκκρινομένους παράγοντες, δοκιμασία κατανάλωση οξυγόνου, έκφραση της πρωτεΐνης UCP1, τόσο στο ποντικίσια όσο και στο ανθρώπινα κύτταρα. Τέλος, τα βελτιστοποιημένα με CRISPR ποντικίσια ή ανθρώπινα «φαιά» λιποκύτταρα εμφυτεύθηκαν σε ποντίκια – λήπτες τα οποία λάμβαναν διατροφή εμπλουτισμένη σε λίπος για την πρόκληση διαβήτη τύπου 2. Τα εμφυτεύματα των τροποποιημένων κυττάρων έδειξαν μικρότερη συσσώρευση σωματικού λίπους μικρότερη συσσώρευση τριγλυκεριδίων στο ηπατικό παρέγχυμα καθώς επίσης βελτίωσαν την ανοχή στη γλυκόζη συγκριτικά με τα ποντίκια – μάρτυρες που έλαβαν εμφυτεύματα μη τροποποιημένων λιποκυττάρων. Παράλληλα, όπως απεδείχθη η παρουσία των συστατικών της CRISPR τροποποίησης ήταν παροδική στα κύτταρα-στόχους καθώς η ενδονουκλεάση Cas9 αποδομείται και δεν είναι ανιχνεύσιμη με ηλεκτροφόρηση ολικής πρωτεΐνης πριν τις εμφυτεύσεις. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν μια θεραπευτική στρατηγική για τη βελτίωση της ομοιόστασης του μεταβολισμού μέσω της γονιδιακής τροποποίησης με CRISPR ανθρώπινων λιποκυττάρων χωρίς την έκθεση του ασθενούς στα ανοσογόνα και δυνητικά επιβλαβή ένζυμο Cas9 και οδηγό sgRNA και άλλων οχημάτων μεταφοράς των συστατικών CRISPR

Συγκριτική αξιολόγηση μαθημάτων εξοικείωσης με το νερό σε ρηχή και βαθιά πισίνα

Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν να συγκρίνει το περιεχόμενο μαθημάτων εξοικείωσης στο νερό σε μαθητές ηλικίας 3-5 ετών σε πισίνα με διαφορετικό βάθος. Στην μελέτη συμμετείχαν δύο ομάδες, από τρεις μαθητές η καθεμία. Η κάθε ομάδα είχε διαφορετική διδάσκουσα. Οι δύο ομάδες συμμετείχαν σε πέντε μαθήματα σε διάρκεια 2,5 εβδομάδων (2/εβδομάδα) με στόχο την ανάπτυξη δεξιοτήτων στο νερό. Τα μαθήματα της μίας ομάδας ολοκληρώθηκαν σε ρηχή πισίνα, ενώ της δεύτερης ομάδας σε βαθιά πισίνα. Τα μαθήματα των δύο ομάδων βιντεοσκοπήθηκαν, με σκοπό την αξιολόγηση και σύγκριση τους. Χρησιμοποιήθηκε φόρμα καταγραφής για κάθε μάθημα, με τα ακόλουθα σημεία παρατήρησης: 1) διάρκεια μαθήματος, 2) αριθμό ασκήσεων, 3) ενεργό χρόνο κίνησης, 4) χρόνο που παραμένει ακίνητος κάθε μαθητής, 5) λεκτική επικοινωνία προπονητή με μαθητές και 6) βαθμό συγκέντρωσης μαθητών. Τα αποτελέσματα των παρατηρήσεων αξιολογήθηκαν στο τέλος όλου του πρακτικού μέρους της έρευνας, από τις δύο ανεξάρτητους παρατηρητές (προπονήτριες) και παρουσιάζονται ως μέση τιμή τυπική απόκλιση. Από τη σύγκριση των ομάδων προκύπτει ότι, όσον αφορά τη διάρκεια μαθήματος, στη ρηχή ήταν μεγαλύτερη από την βαθιά πισίνα (34±1,82 έναντι 31±3,04 λεπτά) και οι μαθητές της ρηχής έκαναν λιγότερες ασκήσεις (10±0,55 έναντι 12±2,47). Επίσης, προκύπτει ότι στην ρηχή πισίνα οι μαθητές κινούνταν περισσότερη ώρα στο νερό από την βαθιά και ως αποτέλεσμα έμεναν λιγότερη ώρα ακίνητοι στο νερό (31,33±2,50 έναντι 25,26±3,80 λεπτά και 2,32±0,68 έναντι 5,56±1,52 λεπτά, αντίστοιχα). Επιπροσθέτως, οι τιμές του τρόπου επικοινωνίας και του βαθμού συγκέντρωσης είναι χαμηλότερες στην ρηχή συγκριτικά με την βαθιά πισίνα (3,47±0,38 έναντι 4,20±0,51 και 3,20±0,50 έναντι 4,07±0,15, αντίστοιχα). Συμπερασματικά, στην ρηχή πισίνα, τα παιδιά φαίνεται να ήταν λιγότερο συγκεντρωμένα. Αντιθέτως, στην βαθιά πισίνα, τα παιδιά έμεναν περισσότερη ώρα ακίνητα και εμφάνισαν υψηλότερη συγκέντρωση στη διάρκεια του μαθήματος.ΟΧ

Post-Doc Talks

Moderator: Dr. Mary Ellen Lane, Dean, Graduate School of Biomedical Sciences and Professor, Neurobiology Presenters: Sneha Shah, Program in Molecular Medicine (Joel Richter lab): “FMRP loss alters the epigenetic landscape and alternative splicing of mRNAs in Fragile X Syndrome” Emmanouela Tsagkaraki, Program in Molecular Medicine (Mike Czech lab): “CRISPR RNP-enhanced adipocyte \u27browning\u27 as cell therapy for metabolic disease” Khursheed Wani, Laboratory of Comparative Immunology (Javier Irazoqui lab): “NHR-49/PAARα and HLH-30/TFEB cooperate for C. elegans host defense via a flavin-containing monooxygenase

Crosstalk between corepressor NRIP1 and cAMP signaling on adipocyte thermogenic programming

Objectives: Nuclear receptor interacting protein 1 (NRIP1) suppresses energy expenditure via repression of nuclear receptors, and its depletion markedly elevates uncoupled respiration in mouse and human adipocytes. We tested whether NRIP1 deficient adipocytes implanted into obese mice would enhance whole body metabolism. Since β-adrenergic signaling through cAMP strongly promotes adipocyte thermogenesis, we tested whether the effects of NRIP1 knock-out (NRIP1KO) require the cAMP pathway. Methods: NRIP1KO adipocytes were implanted in recipient high-fat diet (HFD) fed mice and metabolic cage studies conducted. The Nrip1 gene was disrupted by CRISPR in primary preadipocytes isolated from control vs adipose selective GsαKO (cAdGsαKO) mice prior to differentiation to adipocytes. Protein kinase A inhibitor was also used. Results: Implanting NRIP1KO adipocytes into HFD fed mice enhanced whole-body glucose tolerance by increasing insulin sensitivity, reducing adiposity, and enhancing energy expenditure in the recipients. NRIP1 depletion in both control and GsαKO adipocytes was equally effective in upregulating uncoupling protein 1 (UCP1) and adipocyte beiging, while β-adrenergic signaling by CL 316,243 was abolished in GsαKO adipocytes. Combining NRIP1KO with CL 316,243 treatment synergistically increased Ucp1 gene expression and increased the adipocyte subpopulation responsive to beiging. Estrogen-related receptor α (ERRα) was dispensable for UCP1 upregulation by NRIPKO. Conclusions: The thermogenic effect of NRIP1 depletion in adipocytes causes systemic enhancement of energy expenditure when such adipocytes are implanted into obese mice. Furthermore, NRIP1KO acts independently but cooperatively with the cAMP pathway in mediating its effect on adipocyte beiging