Parazitoidi roda Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae), prirodni neprijatelji kukuruznog plamenca Ostrinia nubilalis (Hübner, 1796) (Lepidoptera: Crambidae)

Maize (Zea mays Linnaeus, 1753) is economically the most important crop in Serbia, while the European corn borer Ostrinia nubilalis (Hübner, 1796) (Lepidoptera: Crambidae) is the its most significant pest of this crop. One of the potentially successful and environmentally friendly method for biological control of this pest is based on the usage of wasps from the genus Trichogramma Westwood, 1833 (Hymenoptera: Trichogrammatidae), which parasitize the egg clusters of European corn borer. From the aspect of biological control of agricultural pests, species of the genus Trichogramma represent the most important parasitoids of harmful Lepidoptera insects. The use of parasitoids of the genus Trichogramma in the biological control of agricultural pests is widely used in many developed countries. However, in certain geographical regions, including the Balkan countries, the potential of these insects in biological control has not yet been fully exploited. Native populations of this genus show a high practical potential in biological control that the agricultural sector of the Republic of Serbia does not use at all. The results of research conducted in Serbia, which show a high capacity for parasitism of indigenous species from local Trichogramma populations, especially when it comes to T. brassicae species, indicate the potential for commercial production of these beneficial insects and their targeted use in biological control of European corn borer. The aim of this review is to indicate the potential of parasitoids of the genus Trichogramma present on the territory of Serbia in programs of biological control of agricultural pests, primarily harmful Lepidoptera such as O. nubilalis.Kukuruz (Zea mays Linnaeus, 1753) predstavlja ekonomski najznačajniju ratarsku kulturu u Srbiji, dok kukuruzniplamenac Ostrinia nubilalis (Hübner, 1796) (Lepidoptera: Crambidae) predstavlja najznačajniju štetočinu ove kulture. Jedna od potencijalno uspešnih i ekološki prihvatljivih metoda za biološko suzbijanje kukuruznog plamenca zasniva se na primeni osica iz roda Trichogramma Westwood, 1833 (Hymenoptera: Trichogrammatidae) koje parazitiraju jajna legla kukuruznog plamenca. Sa aspekta biološke kontrole poljoprivrednih štetočina, vrste iz roda Trichogramma predstavljaju najvažnije parazitoide štetnih Lepidoptera. Upotreba parazitoida iz roda Trichogramma u biološkom suzbijanju poljoprivrednih štetočina ima široku primenu u mnogim razvijenim zemljama sveta. Ipak, u određenim geografskim regionima, uključujući zemlje Balkana, potencijal ovih insekata u biološkoj borbi nije u potpunosti iskorišćen. Nativne populacije vrsta ovog roda pokazuju veliki praktični potencijal u biološkoj kontroli koji sektor poljoprivrede Republike Srbije i dalje uopšte ne koristi. Rezultati sprovedenih istraživanja na teritoriji Srbije koji pokazuju visoki kapacitet parazitizma autohtonih vrsta iz lokalnih Trichogramma populacija, naročito kada je u pitanju vrsta T. brassicae, ukazuju i na potencijalnu mogućnost komercijalne proizvodnje ovih korisnih insekata i njihove ciljane primene u biološkoj kontroli kukuruznog plamenca. Cilj ovog preglednog rada je ukazivanje na potencijal parazitoida iz roda Trichogramma prisutnih na teritoriji Srbije u programima biološke kontrole poljoprivrednih štetočina, pre svega štetnih Lepidoptera poput O. nubilalis

Phenotypic and genotypic detection of multiresistant carbapenemase producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae

Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae su među najznačajnijim uzročnicima infekcija kod ljudi. Problem predstavljaju multirezistentni sojevi koji se javljaju ne samo u bolničkom nego i u vanbolničkom okruženju. Karbapenemi, beta-laktami sa najširim spektrom delovanja, spadaju u lekove poslednje linije odbrane. Rezistencija na karbapeneme među enterobakterijama je u porastu širom sveta. Može nastati usled prisustva karbapenemaza, enzima koji degradiraju karbapeneme, ili usled hiperprodukcije AmpC cefalosporinaza ili beta-laktamaza proširenog spektra uz gubitak porina. Geni koji kodiraju karbapenemaze se nalaze na mobilnim genetičkim elementima koji im omogućavaju brz prenos. Najčešće karbapenemaze su KPC, NDM, VIM, IMP i OXA-48 enzimi. Detekcija sojeva koji produkuju karbapenemaze nije moguća samo na osnovu profila rezistencije izolata, s obzirom da minimalne inhibitorne koncentracije karbapenema mogu biti u referentnom opsegu. Svaki izolat sa smanjenom osetljivošću na karbapeneme bi trebalo ispitati kako bi se sprečilo njihovo širenje. Detekcija karbapenemaza može da se zasniva na fenotipskim i genotipskim metodama. Ciljevi istraživanja su bili da se utvrdi postojanje rezistencije na karbapeneme kod multirezistentnih izolata Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae iz kliničkih uzoraka, da se dokaže produkcija karbapenemaza korišćenjem fenotipskih i genotipskih testova, kao i da se analizira osetljivost izolata Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae sa molekularno dokazanim karbapenemazama. Istraživanje je sprovedeno kao prospektivna studija u periodu 01.11.2013. do 01.11.2014. godine u Centru za mikrobiologiju Instituta za javno zdravlje Vojvodine u Novom Sadu. U istraživanje je bilo uključeno 300 multirezistentnih izolata Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae konsekutivno izolovanih iz kliničkih uzoraka (krv, punktat, sekret iz donjeg respiratornog trakta, urin i sekret rana) hospitalizovanih pacijenata. Identifikacija do nivoa vrste je vršena klasičnim bakteriološkim metodama. Za ispitivanje osetljivosti korišćeni su disk difuziona metoda i gradijent testovi. Vrednosti minimalnih inhibitornih koncentracija su ispitane automatizovanim Vitek 2 sistemom (BioMérieux, Francuska), a interpretacija izvršena u skladu sa preporukama CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Za fenotipsko testiranje prisustva betalaktamaza proširenog spektra korišćen je kombinovani disk test. Za fenotipsko testiranje prisustva karbapenemaza kod sojeva rezistentnih na karbapeneme korišćen je kombinovani disk test i test sinergizma sa dva diska. Detekcija gena za beta-laktamaze blaCTXM, gena za karbapenemaze blaKPC, blaVIM, blaNDM, blaIMP i blaOXA-48-like izvršena je metodom lančane reakcije polimeraze. Genotipizacija odabranih izolata Klebsiella pneumoniae izvršena pomoću repetitivne lančane reakcije polimeraze korišćenjem DiversiLab sistema (BioMérieux, Francuska). Od 300 multirezistetntnih izolata, bilo je 242 (80,7%) Klebsiella pneumoniae i 58 (19,3%) Escherichia coli izolovanih iz kliničkih uzoraka. Smanjenu osetljivost na bar jedan karbapenem (imipenem, meropenem, ertapenem) pokazalo je 179 (59,7%) izolata. Fenotipski test za dokazivanje produkcije betalaktamaza proširenog spektra bio je pozitivan kod 87/171 (50,9%) izolata. Gen blaCTX-M je dokazan kod 111/121 (91,7%) izolata. Fenotipski test za dokazivanje karbapenemaza bio je pozitivan kod 65/179 (36,3%) izolata, kod 63 (96,9%) je ukazivao na prisustvo metalo-beta laktamaza, a kod 2 (3,1%) na prisustvo karbapenemaza iz grupe A. Senzitivnost fenotipskog testa za dokazivanje karbapenemaza klase A i B iznosila je 100,0%, specifičnost 96,6%, a ukupna tačnost 97,6%. Karbapenemaze su nađene kod 79/179 (44,1%) izolata rezistentnih na karbapeneme. Gen blaNDM nađen je kod 58 (32,4%) izolata, blaOXA- 48-like kod 11 (6,1%), a blaKPC kod 2 (1,1%) izolata. Geni blaVIM i blaIMP nisu detektovani. Kod 8 (4,5%) izolata nađena su 2 gena koja kodiraju karbapenemaze, blaNDM i blaOXA-48-like. Određivanjem osetljivosti disk difuzionom metodom i automatizovanim Vitek 2 sistemom, izolati koji produkuju karbapenemaze pokazivali su smanjenu osetljivost na sve testirane beta-laktame i gentamicin, odnosno tobramicin. Visok procenat rezistenicije izolati su pokazali u odnosu na ciprofloksacin, levofloksacin i trimetoprim/sulfametoksazol. Najefikasniji antibiotski lekovi su bili amikacin, tigeciklin, fosfomicin i kolistin. Poređenjem minimalnih inhibitornih koncentracija izolata koji produkuju i izolata koji ne produkuju karbapenemaze utvrđena je statistički značajna razlika za meropenem, imipenem, ertapenem, amikacin, gentamicin. Genotipizacijom odabranih izolata Klebsiella pneumoniae korišćenjem DiversiLab sistema klonalno širenje je dokazano među izolatima koji produkuju NDM i OXA-48-like karbapenemaze u okviru iste zdravstvene institucije, ali i među različitim zdravstvenim ustanovama. Među izolatima rezistentnim na karbapeneme Klebsiella pneumoniae se češće izoluje od Escherichia coli. Kod izolata koji su pokazali smanjenu osetljivost prema bar jednom karbapenemu, karbapenemaze su detektovane u manje od polovine izolata. Kod ostalih izolata dokazane su beta-laktamaze proširenog spektra koje uz gubitak porina mogu uzrokovati rezistenciju na karbapeneme. Kod izolata Klebsiella pneumoniae sa dokazanim genima koji kodiraju karbapenemaze detektovani su pojedinačni blaKPC, blaNDM i blaOXA-48-like geni, kao i kombinacija gena blaNDM i blaOXA-48-like. Kod izolata Escherichia coli nađeni su samo blaNDM geni. Najefikasniji antibiotski lekovi za izolate koji produkuju karbapenemaze su amikacin, tigeciklin, fosfomicin i kolistin. Izolati sa dokazanim karbapenemazama pokazuju rezistenciju na veći broj antibiotika u odnosu na izolate koji ne produkuju karbapenemaze. Dokazano je klonalno širenje izolata Klebsiella pneumoniae koji produkuju karbapenemaze. Testove za fenotipsku detekciju karbapenemaza bi trebalo koristiti i u rutinskim mikrobiološkim laboratorijama u skladu sa EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) preporukama, a konačnu potvrdu treba izvršiti molekularnim metodama u referentnoj laboratoriji.Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae are among the most common human pathogens. Multiresistant strains are emerging not only in hospital settings, but also in the community representing a major concern. Carbapenems, beta-lactams with the broadest spectrum of activity are considered to be antibiotics of last resort. Resistance to carbapenems among enterobacteria is spreading worldwide. It is mainly caused by carbapenemases, enzymes capable of degrading carbapenems or by hyperproduction/overexpression of AmpC betalactamases or extended spectrum betalactamases with porin loss. Carbapenemaseencoding genes are usually located on mobile genetic elements providing their fast transfer. The most common carbapenemases are KPC, NDM, VIM, IMP and OXA-48. The detection of carbapenemase-producer cannot rely only on the resistance profile as their minimal inhibitory concentration values may sometimes lay within the susceptibility range. Therefore, every multidrug-resistant isolates with lower susceptibility to carbapenems should be tested for the presence of carbapenemases in order to prevent further spreading. The detection of carbapenemases is based on phenotypic and genotypic methods. The aims of the study were to determine the occurrence of carbapenem resistance in multidrug-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from clinical samples, to detect carbapenemase production using both phenotypic and genotypic methods and to analyze the susceptibility of carbapenemase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. The study was conducted from 1st November 2013 to 1st November 2014 at the Center for Microbiology in the Institute for Public Health of Vojvodina, Novi Sad, Serbia. The study included 300 nonrepetitive multidrug-resistant strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from clinical specimen (blood, aspirates, lower respiratory tract secretions, urine and wound secretion) of hospitalized patients. Identification of isolated strains was done using conventional bacteriological methods. Antimicrobial susceptibility was tested using the disk diffusion method and MIC test strips. Minimal inhibitory concentrations were determined using Vitek 2 Compact automated system (BioMérieux, France), interpreted according to the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) recommendations. Phenotypic testing of extended-spectrum beta-lactamases production was done using combined disk test. Phenotypic testing of carbapenemase production was done by combined disk test and double-disk synergy test. Detection of blaCTX-M, gene encoding extended-spectrum beta-lactamases and blaKPC, blaVIM, blaNDM, blaIMP i blaOXA-48-like, genes encoding carbapenemases was done using PCR. Genotyping of selected Klebsiella pneumoniae isolates was done by repPCR using DiversiLab system (BioMérieux, France). From the total of 300 multiresistant isolates, 242 (80.7%) were Klebsiella pneumoniae and 58 (19.3%) were Escherichia coli obtained from clinical samples. Reduced susceptibility to at least one carbapenem (imipenem, meropenem, ertapenem) was found in 179 (59.7%) isolates. Phenotypic test for extended-spectrum betalactamases production was positive in 87/171 (50.9%) isolates. A total of 111/121 (91.7%) isolates harbored blaCTX-M. Phenotypic test for carbapenemase production was positive in 65/179 (36.3%) isolates, 63 (96.9%) indicating the presence of metallo-beta-lactamases and 2 (3.1%) indicating the presence of class A carbapenemases. Sensitivity of the phenotypic test for carbapenemase production of class A and B was 100.0%, specificity 96.6% and overall accuracy 97.6%. Carbapenemases were detected in 79/179 (44.1%) carbapenemresistant isolates. Gene blaNDM was found in 58 (32.4%) isolates, blaOXA-48-like in 11 (6.1%) and blaKPC in 2 (1.1%) isolates. Genes blaVIM and blaIMP were not detected. In 8 (4.5%) isolates 2 genes encoding carbapenemases were found, blaNDM and blaOXA-48-like. Using both disk diffusion method and Vitek 2 automated system for antimicrobial susceptibility testing carbapenemase-producing isolates were resistant to all beta-lactams and also to gentamicin and tobramicin respectively. Resistance rates were high for ciprofloxacin, levofloxacin and cotrimoxazole. Good activity maintained for amikacin, tigecycline, fosfomycin and colistin. Comparing minimal inhibitory concentrations of carbapenemaseproducing isolates and non-carbapenemase producers, significant difference was found for meropenem, imipenem, ertapenem, amikacin and gentamicin. Genotyping of selected Klebsiella pneumoniae isolates using DiversiLab system, revealed the clonal spread of NDM- and OXA-48-like-producers not only within one healthcare-setting, but also between different healthcare centers. Among carbapenem-resistant isolates, Klebsiella pneumoniae was found more often than Escherichia coli. Carbapenemases were detected in less than 50% of isolates resistant to at least one carbapenem. In other carbapenem resistant isolates extended-spectrum betalactamases were confirmed most likely causing carbapenem-resistance with porin deficiency or porin loss. Among carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae blaKPC, blaNDM and blaOXA-48-like genes were detected, as well as combination of 2 genes blaNDM and blaOXA-48-like. In carbapenemase-producing Escherichia coli only blaNDM was found. The most efficient antimicrobial drugs among tested carbapenemase-producing isolates were amikacin, tigecycline, fosfomycin and colistin. Carbapenemase-producing isolates were resistant to more antimicrobial agents compared to non-carbapenemase producers. Clonal dissemination of carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae was confirmed. Phenotypic detection of carbapenemase production should be done in routine microbiology laboratories according to EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) recommendations. Final confirmation should be done by molecular methods in the reference laboratory

Phenotypic and genotypic detection of multiresistant carbapenemase producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae

Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae su među najznačajnijim uzročnicima infekcija kod ljudi. Problem predstavljaju multirezistentni sojevi koji se javljaju ne samo u bolničkom nego i u vanbolničkom okruženju. Karbapenemi, beta-laktami sa najširim spektrom delovanja, spadaju u lekove poslednje linije odbrane. Rezistencija na karbapeneme među enterobakterijama je u porastu širom sveta. Može nastati usled prisustva karbapenemaza, enzima koji degradiraju karbapeneme, ili usled hiperprodukcije AmpC cefalosporinaza ili beta-laktamaza proširenog spektra uz gubitak porina. Geni koji kodiraju karbapenemaze se nalaze na mobilnim genetičkim elementima koji im omogućavaju brz prenos. Najčešće karbapenemaze su KPC, NDM, VIM, IMP i OXA-48 enzimi. Detekcija sojeva koji produkuju karbapenemaze nije moguća samo na osnovu profila rezistencije izolata, s obzirom da minimalne inhibitorne koncentracije karbapenema mogu biti u referentnom opsegu. Svaki izolat sa smanjenom osetljivošću na karbapeneme bi trebalo ispitati kako bi se sprečilo njihovo širenje. Detekcija karbapenemaza može da se zasniva na fenotipskim i genotipskim metodama. Ciljevi istraživanja su bili da se utvrdi postojanje rezistencije na karbapeneme kod multirezistentnih izolata Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae iz kliničkih uzoraka, da se dokaže produkcija karbapenemaza korišćenjem fenotipskih i genotipskih testova, kao i da se analizira osetljivost izolata Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae sa molekularno dokazanim karbapenemazama. Istraživanje je sprovedeno kao prospektivna studija u periodu 01.11.2013. do 01.11.2014. godine u Centru za mikrobiologiju Instituta za javno zdravlje Vojvodine u Novom Sadu. U istraživanje je bilo uključeno 300 multirezistentnih izolata Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae konsekutivno izolovanih iz kliničkih uzoraka (krv, punktat, sekret iz donjeg respiratornog trakta, urin i sekret rana) hospitalizovanih pacijenata. Identifikacija do nivoa vrste je vršena klasičnim bakteriološkim metodama. Za ispitivanje osetljivosti korišćeni su disk difuziona metoda i gradijent testovi. Vrednosti minimalnih inhibitornih koncentracija su ispitane automatizovanim Vitek 2 sistemom (BioMérieux, Francuska), a interpretacija izvršena u skladu sa preporukama CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Za fenotipsko testiranje prisustva betalaktamaza proširenog spektra korišćen je kombinovani disk test. Za fenotipsko testiranje prisustva karbapenemaza kod sojeva rezistentnih na karbapeneme korišćen je kombinovani disk test i test sinergizma sa dva diska. Detekcija gena za beta-laktamaze blaCTXM, gena za karbapenemaze blaKPC, blaVIM, blaNDM, blaIMP i blaOXA-48-like izvršena je metodom lančane reakcije polimeraze. Genotipizacija odabranih izolata Klebsiella pneumoniae izvršena pomoću repetitivne lančane reakcije polimeraze korišćenjem DiversiLab sistema (BioMérieux, Francuska). Od 300 multirezistetntnih izolata, bilo je 242 (80,7%) Klebsiella pneumoniae i 58 (19,3%) Escherichia coli izolovanih iz kliničkih uzoraka. Smanjenu osetljivost na bar jedan karbapenem (imipenem, meropenem, ertapenem) pokazalo je 179 (59,7%) izolata. Fenotipski test za dokazivanje produkcije betalaktamaza proširenog spektra bio je pozitivan kod 87/171 (50,9%) izolata. Gen blaCTX-M je dokazan kod 111/121 (91,7%) izolata. Fenotipski test za dokazivanje karbapenemaza bio je pozitivan kod 65/179 (36,3%) izolata, kod 63 (96,9%) je ukazivao na prisustvo metalo-beta laktamaza, a kod 2 (3,1%) na prisustvo karbapenemaza iz grupe A. Senzitivnost fenotipskog testa za dokazivanje karbapenemaza klase A i B iznosila je 100,0%, specifičnost 96,6%, a ukupna tačnost 97,6%. Karbapenemaze su nađene kod 79/179 (44,1%) izolata rezistentnih na karbapeneme. Gen blaNDM nađen je kod 58 (32,4%) izolata, blaOXA- 48-like kod 11 (6,1%), a blaKPC kod 2 (1,1%) izolata. Geni blaVIM i blaIMP nisu detektovani. Kod 8 (4,5%) izolata nađena su 2 gena koja kodiraju karbapenemaze, blaNDM i blaOXA-48-like. Određivanjem osetljivosti disk difuzionom metodom i automatizovanim Vitek 2 sistemom, izolati koji produkuju karbapenemaze pokazivali su smanjenu osetljivost na sve testirane beta-laktame i gentamicin, odnosno tobramicin. Visok procenat rezistenicije izolati su pokazali u odnosu na ciprofloksacin, levofloksacin i trimetoprim/sulfametoksazol. Najefikasniji antibiotski lekovi su bili amikacin, tigeciklin, fosfomicin i kolistin. Poređenjem minimalnih inhibitornih koncentracija izolata koji produkuju i izolata koji ne produkuju karbapenemaze utvrđena je statistički značajna razlika za meropenem, imipenem, ertapenem, amikacin, gentamicin. Genotipizacijom odabranih izolata Klebsiella pneumoniae korišćenjem DiversiLab sistema klonalno širenje je dokazano među izolatima koji produkuju NDM i OXA-48-like karbapenemaze u okviru iste zdravstvene institucije, ali i među različitim zdravstvenim ustanovama. Među izolatima rezistentnim na karbapeneme Klebsiella pneumoniae se češće izoluje od Escherichia coli. Kod izolata koji su pokazali smanjenu osetljivost prema bar jednom karbapenemu, karbapenemaze su detektovane u manje od polovine izolata. Kod ostalih izolata dokazane su beta-laktamaze proširenog spektra koje uz gubitak porina mogu uzrokovati rezistenciju na karbapeneme. Kod izolata Klebsiella pneumoniae sa dokazanim genima koji kodiraju karbapenemaze detektovani su pojedinačni blaKPC, blaNDM i blaOXA-48-like geni, kao i kombinacija gena blaNDM i blaOXA-48-like. Kod izolata Escherichia coli nađeni su samo blaNDM geni. Najefikasniji antibiotski lekovi za izolate koji produkuju karbapenemaze su amikacin, tigeciklin, fosfomicin i kolistin. Izolati sa dokazanim karbapenemazama pokazuju rezistenciju na veći broj antibiotika u odnosu na izolate koji ne produkuju karbapenemaze. Dokazano je klonalno širenje izolata Klebsiella pneumoniae koji produkuju karbapenemaze. Testove za fenotipsku detekciju karbapenemaza bi trebalo koristiti i u rutinskim mikrobiološkim laboratorijama u skladu sa EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) preporukama, a konačnu potvrdu treba izvršiti molekularnim metodama u referentnoj laboratoriji.Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae are among the most common human pathogens. Multiresistant strains are emerging not only in hospital settings, but also in the community representing a major concern. Carbapenems, beta-lactams with the broadest spectrum of activity are considered to be antibiotics of last resort. Resistance to carbapenems among enterobacteria is spreading worldwide. It is mainly caused by carbapenemases, enzymes capable of degrading carbapenems or by hyperproduction/overexpression of AmpC betalactamases or extended spectrum betalactamases with porin loss. Carbapenemaseencoding genes are usually located on mobile genetic elements providing their fast transfer. The most common carbapenemases are KPC, NDM, VIM, IMP and OXA-48. The detection of carbapenemase-producer cannot rely only on the resistance profile as their minimal inhibitory concentration values may sometimes lay within the susceptibility range. Therefore, every multidrug-resistant isolates with lower susceptibility to carbapenems should be tested for the presence of carbapenemases in order to prevent further spreading. The detection of carbapenemases is based on phenotypic and genotypic methods. The aims of the study were to determine the occurrence of carbapenem resistance in multidrug-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from clinical samples, to detect carbapenemase production using both phenotypic and genotypic methods and to analyze the susceptibility of carbapenemase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. The study was conducted from 1st November 2013 to 1st November 2014 at the Center for Microbiology in the Institute for Public Health of Vojvodina, Novi Sad, Serbia. The study included 300 nonrepetitive multidrug-resistant strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from clinical specimen (blood, aspirates, lower respiratory tract secretions, urine and wound secretion) of hospitalized patients. Identification of isolated strains was done using conventional bacteriological methods. Antimicrobial susceptibility was tested using the disk diffusion method and MIC test strips. Minimal inhibitory concentrations were determined using Vitek 2 Compact automated system (BioMérieux, France), interpreted according to the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) recommendations. Phenotypic testing of extended-spectrum beta-lactamases production was done using combined disk test. Phenotypic testing of carbapenemase production was done by combined disk test and double-disk synergy test. Detection of blaCTX-M, gene encoding extended-spectrum beta-lactamases and blaKPC, blaVIM, blaNDM, blaIMP i blaOXA-48-like, genes encoding carbapenemases was done using PCR. Genotyping of selected Klebsiella pneumoniae isolates was done by repPCR using DiversiLab system (BioMérieux, France). From the total of 300 multiresistant isolates, 242 (80.7%) were Klebsiella pneumoniae and 58 (19.3%) were Escherichia coli obtained from clinical samples. Reduced susceptibility to at least one carbapenem (imipenem, meropenem, ertapenem) was found in 179 (59.7%) isolates. Phenotypic test for extended-spectrum betalactamases production was positive in 87/171 (50.9%) isolates. A total of 111/121 (91.7%) isolates harbored blaCTX-M. Phenotypic test for carbapenemase production was positive in 65/179 (36.3%) isolates, 63 (96.9%) indicating the presence of metallo-beta-lactamases and 2 (3.1%) indicating the presence of class A carbapenemases. Sensitivity of the phenotypic test for carbapenemase production of class A and B was 100.0%, specificity 96.6% and overall accuracy 97.6%. Carbapenemases were detected in 79/179 (44.1%) carbapenemresistant isolates. Gene blaNDM was found in 58 (32.4%) isolates, blaOXA-48-like in 11 (6.1%) and blaKPC in 2 (1.1%) isolates. Genes blaVIM and blaIMP were not detected. In 8 (4.5%) isolates 2 genes encoding carbapenemases were found, blaNDM and blaOXA-48-like. Using both disk diffusion method and Vitek 2 automated system for antimicrobial susceptibility testing carbapenemase-producing isolates were resistant to all beta-lactams and also to gentamicin and tobramicin respectively. Resistance rates were high for ciprofloxacin, levofloxacin and cotrimoxazole. Good activity maintained for amikacin, tigecycline, fosfomycin and colistin. Comparing minimal inhibitory concentrations of carbapenemaseproducing isolates and non-carbapenemase producers, significant difference was found for meropenem, imipenem, ertapenem, amikacin and gentamicin. Genotyping of selected Klebsiella pneumoniae isolates using DiversiLab system, revealed the clonal spread of NDM- and OXA-48-like-producers not only within one healthcare-setting, but also between different healthcare centers. Among carbapenem-resistant isolates, Klebsiella pneumoniae was found more often than Escherichia coli. Carbapenemases were detected in less than 50% of isolates resistant to at least one carbapenem. In other carbapenem resistant isolates extended-spectrum betalactamases were confirmed most likely causing carbapenem-resistance with porin deficiency or porin loss. Among carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae blaKPC, blaNDM and blaOXA-48-like genes were detected, as well as combination of 2 genes blaNDM and blaOXA-48-like. In carbapenemase-producing Escherichia coli only blaNDM was found. The most efficient antimicrobial drugs among tested carbapenemase-producing isolates were amikacin, tigecycline, fosfomycin and colistin. Carbapenemase-producing isolates were resistant to more antimicrobial agents compared to non-carbapenemase producers. Clonal dissemination of carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae was confirmed. Phenotypic detection of carbapenemase production should be done in routine microbiology laboratories according to EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) recommendations. Final confirmation should be done by molecular methods in the reference laboratory

Predatorska stenica Nesidiocoris tenuis (Heteroptera: Miridae), prirodni neprijatelj štetnih insekta u plasteničkoj proizvodnji paradajza

Species of zoophytophagous genus Dicyphina, plant bugs (Hemiptera: Miridae: Bryocorinae) are among the most abundant and effective predators of tomato pests. Nesidiocoris tenuis Reuter, 1895 (Hemiptera: Miridae) is the predominant species of Dicyphina sp. and it is considered to be a major natural enemy of insect pests in tomato crops in the Mediterranean region. This predatory bug is proved to be particularly successful in suppressing Tuta absoluta Meadow, 1917 (Lepidoptera: Gelechiidae), a major pest of tomato in greenhouse production. Aims of the study were to 1) investigate the efficiency of the mirid predatory bug N. tenuis in greenhouse tomato production and 2) to estimate the possibilities of its application in commercial vegetable production in Western Balkan countries of Europe. The significance of the study results relies on the possibility of commercialisation and general promotion of biological agent N. tenuis in tomato production in South East part of Europe, where the usage of pesticides still dominates the field of plant protection, both in vegetables and other agricultural sectors. According to the obtained results, the biological agent N. tenuis represents a reliable tool for controlling the level of the tomato leaf miner population by keeping the pest below its economic and intervention threshold.Zoofitofagne vrste iz roda Dicyphina (Hemiptera: Miridae: Briocorinae) spadaju u grupu najzastupljenijih i najefikasnijih predatora štetočina paradajza. U usevima paradajza, vrsta Nesidiocoris tenuis Reuter, 1895 (Hemiptera: Miridae) je najzastupljeniji predstavnik roda Dicyphina i smatra se najvažnijim prirodnim neprijateljem štetočina paradajza u Mediteranskoj regiji. Ova predatorska stenica se pokazala posebno uspešno u suzbijanju moljca paradajza Tuta absoluta, 1917 (Lepidoptera: Gelechiidae), glavne štetočine u proizvodnji paradajza u zatvorenom prostoru. Ciljevi sprovedenog istraživanja su 1) ispitivanje efikasnosti predatorske stenice N. tenuis u proizvodnji paradajza u zatvorenom prostoru, odnosno 2) procena njene praktične primene u komercijalnoj proizvodnji povrća u zemljama zapadnog Balkana. Dobijeni rezultati doprinose promovisanju biološkog agensa N. tenuis i ukazuju na mogućnost komercijalne upotrebe ove predatorske stenice u proizvodnji paradajza u jugoistočnom delu Evrope, gde primena pesticida i dalje dominira u oblasti zaštite bilja, kako u povrtarstvu tako i u drugim poljoprivrednim sektorima. Prema dobijenim rezultatima, biološki agens N. tenuis predstavlja efikasno sredstvo za suzbijanje T. absoluta, kontrolom brojnosti populacije moljca paradajza ispod nivoa ekonomskog praga štetnosti

Jesu li testovi praćenja oksidacijskog stresa dovoljni za genetički monitoring hrasta lužnjaka u malom razmjeru?

SummaryAlthough being present much widely in terms of its geographical distribution, pedunculate oak (Quercus robur L.) represents one of the crucial species in forest ecosystems in South Eastern Europe. We wanted to contribute to existing efforts in designing genetic monitoring methodology for this noble broadleaved species, through the screening of genotypes with different health status and belonging to two phenological varieties [early (var. praecox) vs late (var. tardissima)] using seven oxidative stress parameters (total protein content, total phenolic compounds content, total flavonoids content, DPPH, ABTS, NO radical scavenger activities and Ferric reducing antioxidant power essay - FRAP). Results of this study provided significant biological message, contributing to better understanding of existing biodiversity of pedunculate oak in Serbia. Four out of seven oxidative stress screening tests (total phenolic compounds content, total flavonoids content, RSC NO and FRAP) clearly discriminated late vs early individuals sampled from selected pedunculate oak gene pool. Although presented results did not show significancy in using mentioned parameters to distinct damaged from vital individuals, nevertheless, knowledge gained through discussion and comparison with previous studies contributed to precise determination of biochemical tests which might be used in future efforts of genetic monitoring of this species.SažetakPrema klimatskim scenarijima RCP-a, hrast lužnjak (Q. robur L.) označen je kao najteže pogođena vrsta drveća zbog stalnih, intenzivnih klimatskih promjena. Propadanje hrastovih šuma može uzrokovati velike ekonomske gubitke, budući da se hrastovi smatraju vrlo vrijednim primjercima drveća zbog duge povijesti iskorištavanja za proizvodnju drva i gradnju (Mikac i sur., 2018.). Uzimajući u obzir da uobičajeni biokemijski parametri mogu doprinijeti razumijevanju temeljnih obrambenih mehanizama biljaka protiv stresa od suše i stoga se koristiti kao pouzdani deskriptori prilagodljivosti u kontekstu klimatskih promjena, cilj ove studije bio je utvrditi postoji li neki od 7 predloženih testova praćenja oksidacijskog stresa (ukupni sadržaji bjelančevina, fenola, flavonoida i testovi hvatači slobodnih radikala – ABTS, NO, FRAP i DPPH) koji može poslužiti za dugoročni genetski monitoring dviju sorti hrasta lužnjaka (rani vs kasni). Fenološki varijeteti [rani (var. praecox) vs kasni (var. tardissima)] i fiziološka skupina (vitalne ili oštećene) bile su promatrane varijable u testiranih jedinki zbirnog radnog hrasta vitalnog (PEOV), zbirnog ranog hrasta oštećenog (PEOD), zbirnog kasnog vitalnog (PLOV) i zbirnog ranog oštećenog (PLOD). Svaka objedinjena (zbirna) skupina sadržavala je ukupno 10 ili 11 uzoraka, mjerenih u tri primjerka kako bi se postigla optimalna statistička značajnost za svaku skupinu (za više, pogledajte pododjeljak Statistika). Sakupljeno lišće odmah je označeno i stavljeno u aluminijski folij, konzervirano na suhom ledu i transportirano u Laboratorij za kemijske i biokemijske analize Instituta za nizinsko šumarstvo i okoliš (ILFE) na daljnju obradu. Dva grama hrastovog lišća homogenizirano je u ohlađenom mužaru s tučkom s 10 ml fosfatnog pufera (0,1 M KH2PO4, pH=7), centrifugirano 10 min na 11000 okretaja u minuti i supernatant je korišten za daljnji test praćenja oksidativnog stresa (Tablica 1), prema uputama autora. Sve analize određene su spektrofotometrijski u mikropločicama s čitačem Multiplate MultiScan GO (Thermo Scientific, Njemačka). Dobiveni rezultati biokemijskih parametara pokazali su da je lišće kasnog hrasta imalo veći sadržaj bjelančevina i fenolnih spojeva od ranog, bez obzira na fiziološku skupinu (vitalno ili oštećeno) (Tablica 2). Štoviše, radi boljeg prikaza rezultata iz Tablice 2. prikazali smo ih grafički (Graf 1. i 2.). Najveći udio ukupnih flavonoida imali su listovi PLOD i PLOV, a najmanji listovi PEOV i PEOD (Tablica 2). Što se tiče ispitivanja kapaciteta hvatanja radikala, svi testirani listovi imali su nizak kapacitet hvatanja. ABTS- i NO- testovi hvatači radikala pokazali su manje od 50% hvatanja za sve uzorke, dok je DPPH-test pokazao neznatno više od 50% hvatanja za PEOD, PEOV, PLOV listove (56,15%, 57,28% odnosno 51,58%) i 41,69 % za listove PLOD. Kasno lišće hrasta ima veću antioksidacijsku moć reduciranja željeza (203,5 odnosno 180,4 mg TE/g FW) nego rano (93,9 odnosno 85,5 mg TE/g FW), bez obzira na fiziološku skupinu (Tablica 2). Razlike između ranih i kasnih genotipova hrasta bile su značajnije u pogledu ukupnog sadržaja fenola i flavonoida, kao i antioksidativne moći reduciranja željeza (FRAP). Ovo zapažanje također je potvrđeno PCA analizom, gdje su sva tri parametra grupirana zajedno s malom razlikom u najdominantnijoj komponenti PC1 (Graf 3). Dvosmjerna ANOVA u našem slučaju pokazala je da fiziološko grupiranje nije imalo utjecaja na ukupni sadržaj fenola i naknadno na aktivnost hvatača radikala FRAP, ABTS i NO. Dobiveni rezultati mogu pomoći da se objasne razlike u biokemijskim odgovorima na abiotičke stresove stabala hrasta lužnjaka na različitim mikrolokalitetima i na razini varijeteta unutar jednog šumskog kompleksa te nam mogu pružiti vrijedne informacije o varijabilnosti unutar vrste u otpornosti na sušu (rano naspram kasno). Stoga ovo može biti važan alat za poboljšanje strategija uzgoja i planova umjetne regeneracije hrasta lužnjaka u sušnijim nizinskim regijama. S obzirom na rezultate, potrebno je dugoročno mjerenje parametara oksidacijskog stresa stabala hrasta na individualnoj i populacijskoj razini, kako bi se dobila jasnija slika o tome kakve se promjene događaju na molekularnoj razini. Ova mjerenja također mogu biti korisna u genetskom praćenju stabala hrasta postavljenih u polukontroliranim i kontroliranim uvjetima. Na taj način bi se mogao dobiti uvid u točan genetski kapacitet vrsta drveća u pogledu njihove otpornosti na abiotski stres na pojedinim mikrolokalitetima unutar krajolika

Molecular Technologies in Serbian Lowland Forestry under Climate Changes - Possibilities and Perspectives

Background and Purpose: Vojvodina province, the northern part of the Republic of Serbia, is predominantly lowland agricultural region with over 75% of arable land which in previous years, has been highly impacted by drought. The annual precipitation is lower than 700 mm and it is the limit for the growth and development of natural forest vegetation. Unfortunately, the atmospheric precipitation is still a major source of water for plant biodiversity. Taking these facts into account, it is highly recommended to primarily use the xerothermic tree species, which have a well-developed root system for “classical” afforestation. Some species from Salicaceae and Fagaceae like poplars, willows, oaks and beeches are surely the best option for afforestation in temperate zones strongly influenced by drought. Conclusions: In order to develop stress-based genomic information in Populus and the rest of woody plant species from Vojvodina, an integrated genetic research needs to be done. The aim of this particular paper is to analyse and summarize data regarding stress-based biotechnology perspectives in Vojvodina and to give recommendations for future forest tree breeding. Drought as a strong negative ecological factor must be carefully considered. In order to achieve sustainability, new forest management plans must consider wide approaches, from molecular to ecosystem level

HPLC/MS-TOF Analysis of Surface Resins from Three Poplar Clones Grown in Serbia

Background and Purpose: Poplar clones grown in Serbia are fast growing tree species important for many different purposes in forestry and industry. In this study chemical content of the surface resins of three poplar clones grown in Serbia -M1, B229 and PE 19/66 was analyzed, aiming at their potential usage as a source of natural products important for pharmacy and chemotaxonomy. Materials and Methods: Using HPLC/MS-TOF we gained the first information on chemical compounds which comprise of resins on terminal twigs cuttings of commonly grown poplar clones. Provided from the nursery of the Institute of Lowland Forestry and Environment (Serbia), terminal twigs cuttings with leaves of different development stage from two year old seedlings of M1 poplar clone (Populus euramericana L.), PE 19/66 clone and B229 clone (both belonging to Populus deltoides) were sampled. The washing of the surface resins from terminal twigs cuttings of every sample was done with methylene-chloride until the samples were prepared for HPLC/MS-TOF analysis. Results: Out of 38 different compounds which were identified, M1 clone qualitatively differed for 14 compounds as compared to two other clones. Generally, the results showed that the composition of the resins consisted of different phenolic acids, phenolic esters, flavonoids and other contents. Conclusion: These three poplar clones are potent producers of pharmacologically and chemotaxonomically potent compounds in forest ecosystems, especially M1 clone

Molecular mechanisms of woody plant species abiotic stress response

Sve učestalije i intenzivnije promene faktora spoljašnje sredine deluju na biljke kao stres. Suočene sa ovim promenama biljke su razvile mehanizme tolerancije i adaptacije, koji im omogućavaju opstanak. Ovi mehanizmi funkcionišu na morfološkom, fiziološkom, biohemijskom i molekularnom nivou, međusobno su povezani, regulisani i usklađeni u integrisani sistem odgovora na promene u životnoj sredini. Mnogi ključni regulatorni i funkcionalni molekuli koji učestvuju u odgovoru na abiotički stres su identifikovani i time je otvorena mogućnost primene novih strategija u upravljanju stresom. Tema ovog rada su molekularni i biohemijski mehanizmi odgovora drvenastih vrsta biljaka na različite tipove abiotičkog stresa, sa posebnim osvrtom na topole.More frequent and more intense changes in environmental factors act as a stress on the plants. Faced with these changes, plants have developed mechanisms of tolerance and adaptation, which enable them to survive. These mechanisms operate on the morphological, physiological, biochemical and molecular level, are interconnected, regulated and coordinated in an integrated system response to changes in the environment. Many key regulatory and functional molecules involved in the response to abiotic stress are identified, thus opening the possibility for implementation of new strategies in the stress management. This paper outlines the molecular and biochemical mechanisms of response of woody plants to different types of abiotic stress, with special emphasis on poplars

UTJECAJ ONEČIŠĆENOSTI TLA TEŠKIM METALIMA NA KLONOVE TOPOLA IZ SRBIJE

Oxidative stress is known as disturbed balance between antioxidative protection mechanism and production of reactive oxygen species, which can negatively influence on normal biological and metabolical processes in living organisms, such as poplar species. Phytoremediation is promising biotechnical method of cleaning of polluted soils by various pollutants: heavy metals, organic contaminants, pesticides, oil etc. Until today, poplars showed potential for regenerating polluted soils during phytoremediation process. This study represents results of oxidative stress profiles of three poplar clones (M1, B229 and PE 19/66) shoots from Institute of Lowland Forestry and Environment, University of Novi Sad, Serbia, while being treated by different concentration of three heavy metals in soil: Ni3+, Cu2+ and Cd2+. Biochemical parameters of oxidative stress which have been analyzed were: content of soluble proteins, intensity of lipid peroxidation, antioxidative capacity by ferric reducing antioxidative power assay and activity of superoxid dismutase. Results showed that the most acceptable phytoremediation response to heavy metal pollution in soil showed clone M1. Great differences between B229 and PE 19/66 clones were in response on soil heavy metal contamination, directly suggesting of not being suitable for possible phytoremediation application.Oksidacijski stres je poznat kao narušena ravnoteža između antioksidacijskog mehanizma zaštite i proizvodnje reaktivnih kisikovih vrsta, što može negativno utjecati na normalne biološke i metaboličke procese u živim organizmima, kao na primjer kod topola. U cilju opstanka, aerobni organizmi su stekli mehanizme antioksidacijske zaštite, gdje su od enzimskih najistraženije aktivnosti antioksidativnih enzima kao što su katalaze, peroksidaze, glutation peroksidaze i superoksid dismutaza. Fitoremedijacija je obećavajuća biotehnička metoda čišćenja zagađenih tala raznim onečišćujućim tvarima poput: teških kovina, organskih kontaminanata, pesticida i dr. Do danas, topole su pokazale potencijal za regeneraciju onečišćenih tala tijekom fitoremedijacijskog procesa.Biokemijsko profiliranje statusa oksidacijskog stresa u drvenastim biljkama nije često istraživana u Srbiji i stoga je cilj ovoga pokusa bio ispitati utjecaj različitih koncentracija tri jona teških kovina, Ni3+, Cu2+ i Cd2+ na razinu oksidacijskog stresa tri klona, dvije različite vrste topole (Populus euramericana-M1; PE 19/66 i B-229 oba Populus deltoides vrsta). Biokemijski parametri za određivanje razine oksidacijskog stresa su: lipidna peroksi­dacija (LPx), test redukcijske snage željeza (FRAP), superoksid dismutaze (SOD) aktivnost i sadržina topivih bjelančevina. Ovi rezultati mogli bi dati smjernice u odabiru klonova iz kolekcije Instituta za nizijsko šumarstvo i životnu sredinu Univerziteta u Novom Sadu za buduće fitoremedijacijske uporabe ovih genotipova topola. Pješčano fluvisol tlo u pokusnim posudama je zagađeno različitim tretmanima teških kovina, koji su prikazani u tablici 1. Biljni ekstrakti izrađeni su od 2 g biljnog materijala (izbojci) i homogenizirani s kvarcnim pijeskom i suspenzirani u 10 cm3 0,1 mol/dm3 K2HPO4 pH 7,0. Homogenati su centrifugirani za 10 min na 4000 g (Quy Hai sur., 1975). Sva očitavanja apsorbancija za sadržaj topivih proteina, SOD i FRAP odrađeno pomoću Janway UV / VIS spektrofotometra 6505 i za čitanje količine nastalog MDA korišten je višefrekvencijski Spectrum Termo Corporation.Sve analize izvedene su u tri ponavljanja. Statistička usporedba između uzoraka izvedena je u programu Statistica 9, koristeći Duncan test, s statističkom značajnosti p <0,05. Dobiveni rezultati prikazani su grafički preko histograma (slike 1. do 4.) i iznad njih su slova koja označuju statistički značajne razlike između rezultata i kontrola (od a do e).Usporedni postotak je izračunat prema formuli: Δ (%) = (100 * uzorak / kontrola) –100, gdje vrijednosti mogu rezultirati pozitivno (+) ako je došlo do povećanja u odnosu na kontrolu i rezultiralo negativno (–), ako je došlo do smanjenja u odnosu na kontrolu.Trudić i sur. (2012) analizirali su kroz iste metode okdisacijskog stresa ekstrakte lišća i korijena spomenutih klonova topola. Uspoređujući ove rezultate, B229 klon je kroz lišće i korijenje pokazao više prihvatljiv antioksidacijski odgovor, dok je, u ovom istraživanju, M1 klon pokazao najprihvatljivije antioksidacijske odgovore kroz ekstrakte izbojaka. Parametri iz Pilipović i sur. (2012), Trudić i sur. (2012) i naše studije, mogu predstavljati udružen fiziološki i antioksidacijski marker sustav za buduće različite fitoremedijacijske primjene ovih klonova na tlima onečišćenim raznim tvarima.Rezultati ovog istraživanja mogu ukazati na genotipske specifičnosti svih ispitivanih biokemijskih parametara i obilježava klonove topola, kao što je M1 kao primarni, a B229 klon kao potencijalno sljedeći u primjeni fitoremedijacije tala onečišćenih teškim kovinama. Ipak, za stjecanje novih, dubljih rezultata u vezi s oksidacijskim stresom izazvanim onečišćavanjem tala teškim kovinama, potrebne su dalje in vitro antioksidacijske analize