Zooming in on Transcription Preinitiation

AbstractClass II gene transcription commences with the assembly of the Preinitiation Complex (PIC) from a plethora of proteins and protein assemblies in the nucleus, including the General Transcription Factors (GTFs), RNA polymerase II (RNA pol II), co-activators, co-repressors, and more. TFIID, a megadalton-sized multiprotein complex comprising 20 subunits, is among the first GTFs to bind the core promoter. TFIID assists in nucleating PIC formation, completed by binding of further factors in a highly regulated stepwise fashion. Recent results indicate that TFIID itself is built from distinct preformed submodules, which reside in the nucleus but also in the cytosol of cells. Here, we highlight recent insights in transcription factor assembly and the regulation of transcription preinitiation

Getting a Grip on Complexes

We are witnessing tremendous advances in our understanding of the organization of life. Complete genomes are being deciphered with ever increasing speed and accuracy, thereby setting the stage for addressing the entire gene product repertoire of cells, towards understanding whole biological systems. Advances in bioinformatics and mass spectrometric techniques have revealed the multitude of interactions present in the proteome. Multiprotein complexes are emerging as a paramount cornerstone of biological activity, as many proteins appear to participate, stably or transiently, in large multisubunit assemblies. Analysis of the architecture of these assemblies and their manifold interactions is imperative for understanding their function at the molecular level. Structural genomics efforts have fostered the development of many technologies towards achieving the throughput required for studying system-wide single proteins and small interaction motifs at high resolution. The present shift in focus towards large multiprotein complexes, in particular in eukaryotes, now calls for a likewise concerted effort to develop and provide new technologies that are urgently required to produce in quality and quantity the plethora of multiprotein assemblies that form the complexome, and to routinely study their structure and function at the molecular level. Current efforts towards this objective are summarized and reviewed in this contribution

Subunits of ADA-two-A-containing (ATAC) or Spt-Ada-Gcn₅-acetyltrasferase (SAGA) coactivator complexes enhance the acetyltransferase activity of GCN₅

Histone acetyl transferases (HATs) play a crucial role in eukaryotes by regulating chromatin architecture and locus specific transcription. GCN5 (KAT2A) is a member of the GNAT (Gcn5-related N-acetyltransferase) family of HATs. In metazoans this enzyme is found in two functionally distinct coactivator complexes, SAGA (Spt Ada Gcn5 acetyltransferase) and ATAC (Ada Two A-containing). These two multiprotein complexes comprise complex-specific and shared subunits, which are organized in functional modules. The HAT module of ATAC is composed of GCN5, ADA2a, ADA3, and SGF29, whereas in the SAGA HAT module ADA2b is present instead of ADA2a. To better understand how the activity of human (h) hGCN5 is regulated in the two related, but different, HAT complexes we carried out in vitro HAT assays. We compared the activity of hGCN5 alone with its activity when it was part of purified recombinant hATAC or hSAGA HAT modules or endogenous hATAC or hSAGA complexes using histone tail peptides and full-length histones as substrates. We demonstrated that the subunit environment of the HAT complexes into which GCN5 incorporates determines the enhancement of GCN5 activity. On histone peptides we show that all the tested GCN5-containing complexes acetylate mainly histone H3K14. Our results suggest a stronger influence of ADA2b as compared with ADA2a on the activity of GCN5. However, the lysine acetylation specificity of GCN5 on histone tails or full-length histones was not changed when incorporated in the HAT modules of ATAC or SAGA complexes. Our results thus demonstrate that the catalytic activity of GCN5 is stimulated by subunits of the ADA2a- or ADA2b-containing HAT modules and is further increased by incorporation of the distinct HAT modules in the ATAC or SAGA holo-complexes

Funktionale und strukturelle Untersuchung von spleißosomalen snRNPs

In die Expression der meisten eukaryontischen Protein-kodierenden Gene sind Prozessierungsschritte von Vorläufermolekülen der Boten-RNAs (engl. pre-mRNAs), wie z. B. das Spleißen von pre-mRNAs, involviert. Das Spleißen von pre-mRNAs wird von einem aus mehreren Untereinheiten bestehenden Protein-RNA-Enzym, dem Spleißosom, katalysiert. Das Spleißosom lagert sich schrittweise an hochkonservierten Sequenzen des pre-mRNA-Substrats zusammen und wird aus mehreren kleinen Ribonukleoproteinpartikeln (engl. snRNPs) und nicht-snRNP-Proteinen gebildet. In Hefen und Menschen ist das U2 snRNP eine essentielle Komponente beim Spleißen von pre-mRNA-Molekülen, wobei es während der Bildung des Spleißosoms an der Erkennung bzw. Auswahl der Verzweigungsstellen (engl. branch sites) der pre-mRNA-Moleküle und auch während der Katalyse der Spleißreaktion eine Rolle spielt. Ein 12S U2 snRNP besteht aus der U2 snRNA, welche im Komplex mit zwei U2 snRNP-spezifischen Proteinen, U2-A und U2-B , vorliegt, und einem Satz aus sieben so genannten Sm-Proteinen. In katalytisch-aktiven 17S U2 snRNPs sind zusätzlich zwei heteromere Spleißfaktoren zu finden, SF3a und SF3b, welche aus drei (SF3a120, SF3a66 und SF3a60) bzw. sieben (SF3b155, SF3b145, SF3b130, SF3b49, SF3b14a/p14, SF3b14b und SF3b10) Proteinen bestehen. In der Hefe Saccaromyces cerevisiae wurde gezeigt, dass neben den Hefe-Orthologen Hsh155p, Rse1p, Cus1p, Hsh49p, Rds3p und Rcp10p/Ysf3p mindestens zwei weitere Proteine, Bud31p und Snu17p/Ist3p, in SF3b Partikeln präsent sind. Außerdem ist Snu17p auch in einem Komplex mit den Proteinen Pml1p und Bud13p enthalten. Diese drei Proteine formen den pre-mRNA retention and splicing (RES) Komplex, dessen Aktivität dem Austreten von ungespleißten pre-mRNAs aus dem Nukleus entgegenwirkt und welcher für die Aktivierung des Spleißens eines Teils von Mer1p-abhängigen Genen benötigt wird. Ein homologer Komplex ist in humanen präkatalytischen, aktivierten und Schritt 1-Spleißosomen zu finden. Strukturelle Analysen mit Hilfe der Elektronenmikroskopie, Kernresonanzspektroskopie und Röntgenkristallographie lieferten wichtige Einblicke in die Strukturen von 17S U2 snRNP Subkomplexen und Proteinen, allerdings liegen noch keine Modelle von 12S U2 snRNPs, Partikeln des SF3b, sowie des RES Komplexes mit atomarer Auflösung vor. Um atomar aufgelöste Modelle von humanen 12S U2 snRNPs und SF3b Partikeln zu erhalten, begann ich, diese Partikel für Röntgenstrukuranalysen zu produzieren. Ich konnte Reinigungsprotokolle für native, aus HeLa-Zellkultur isolierte 12S U2 snRNPs und SF3b Partikel für kristallographische Analysen optimieren. Da keine Kristalle aus nativen 12S U2 snRNPs gezüchtet werden konnten, wurden vermutlich unstrukturierte Bereiche der U2 snRNA, der Sm-Proteine Sm B/B und der Proteine U2-A und U2-B mit Hilfe eines DNA-gelenkten RNaseH Schnitts, sowie limitierter Proteolyse, erfolgreich entfernt. U2 snRNP Partikel mit verkürzter snRNA oder mit verkürzter snRNA und verkürzten Proteinen Sm B/B wurden der Kristallisation bei einer Konzentration von 10 mg/ml zugeführt. U2 snRNPs mit verkürzter snRNA und verkürzten Proteinen Sm-B/B , U2-A und U2-B konnten in analytischem Maßstab gereinigt werden. Die etablierten Reinigungsprotokolle erlauben eine zukünftige präparative Produktion der Partikel. SF3b Partikel wurden gereinigt und auf Kristallwachstum bei Konzentrationen von mindestens 9 mg/ml überprüft. Während der Präparation von SF3b Partikeln konnte ein bis dato unbekannter Komplex isoliert und charakterisiert werden. Dieser Komplex besteht aus mindestens vier Komponenten, einer DEAD-box Helikase DDX1, sowie den Proteinen HSPC117, Family with sequence similarity 98/member B und CGI-99. Die Assoziation dieses Komplexes mit SF3b Partikeln wird diskutiert. Um das Wissen über das Protein Snu17p und seiner Interaktionspartner zu erweitern, beschäftigte ich mich ferner mit der Charakterisierung des RES Komplexes aus der Bäckerhefe. Hierbei verwendete ich verschiedene, biophysikalische und biochemische Methoden, um die Architektur dieses Komplexes aufzuklären. GST pull-down Experimente und Größenausschlußchromatographie zeigten, dass Snu17p die zentrale Plattform des Komplexes darstellt, wohingegen die zwei anderen Komponenten, Pml1p und Bud13p, nicht miteinander interagieren. Fluorimetrische Struktursondierungen zeigten, dass das gesamte Bud13p und der N-terminale Bereich des Pml1p nativ ungefaltet in isolierter Form vorliegen. Mutationsanalysen und Tryptophanfluoreszenzmessungen bestätigten, dass ein konserviertes Tryptophan-haltiges Motiv im C-terminalen Bereich des Bud13p mit dem Kernbereich des RNA-Bindemotivs des Snu17p interagiert. Ferner zeigten diese Experimente, dass eine C-terminale Extension des RNA-Bindemotivs des Snu 17p für die Binding eines N-terminalen Peptids des Pml1p notwendig ist. Über isothermale Titrationskalorimetrie konnten 1:1 Stöchiometrien, große negative Bindungsentropien und Dissoziationskonstanten im niedrigen nanomolaren, bzw. mikromolaren Bereich für die Snu17p-Bud13p und die Snu17p-Pml1p Interaktionen gezeigt werden. Durch peptide-scanning Experimente konnten die Interaktionsregionen zu Snu17p in Bud13p und Pml1p auf die Aminosäure genau definiert werden. Vorläufige Ergebnisse aus Untersuchungen mit Hilfe der NMR Spektroskopie und limitierter Proteolyse zeigten, dass Snu17p als molten globule-ähnliche Struktur vorliegt und sich durch die Bindung von mindestens einem Interaktionspartner faltet. Folglich interagiert das nicht-kanonische RNA-Bindemotiv des Snu17p mit kurzen, intrinsisch ungefalteten Peptid-Epitopen verschiedener Proteine und agiert dabei als Plattform, um funktionale Module, wie eine forkhead-assoziierte (FHA) Domäne des Pml1p oder ein konserviertes poly-Lysin-Motiv des Bud13p, zu präsentieren. Die Kristallstrukturen des gesamten Pml1p und eines N-terminal verkürzten Pml1p konnten gelöst werden und bestätigten das Vorhandensein einer FHA-Domäne in der C-terminalen Region. FHA-Domänen sind kleine Proteinmodule, welche phosphorylierte Epitope anderer Proteine binden können. Die ersten 50 Reste des Pml1p sind ungeordnet und für die Bindung zum Snu17p verantwortlich. Eine nicht-kanonische N-terminale Verlängerung des Moduls läuft entlang eines -Faltblattes und stabilisiert dadurch die FHA-Domäne des Pml1p. Über strukturbasierte Sequenzvergleiche konnte eine ähnliche Verlängerung im humanen Protein NIPP1 gefunden werden. Interessanterweise wurde NIPP1 erst kürzlich als Spleißosom-assoziiertes Protein beschrieben. Im Kristall des voll-längen Pml1p konnte ein Sulfat-Ion gefunden werden, welches durch Reste der putativen Phosphopeptid-bindenden Schleifenstrukturen koordiniert wird. Kristalle des verkürzten Pml1p Proteins wiesen kein Sulfat-Ion auf, zeigten aber eine nahezu gleiche Struktur des geordneten Bereichs des Pml1p. Eine lange Schleifenstruktur, welche der Phosphopeptid-bindenden Region angrenzt, ist in beiden Strukturen ungeordnet und könnte für die Ligand-Spezifität eine Rolle spielen. Wahrscheinlich erkennt Pml1p phosphorylierte Aminosäuren in Liganden über ein Schlüssel-Schloß-Prinzip, wohingegen die Spezifität womöglich auf einer induced-fit-Interaktion beruht. Die vorgelegten Resultate lassen vermuten, dass Pml1p als Phosphorylierungssensor durch Snu17p zum Spleißosom rekrutiert wird. Basierend auf den in dieser Arbeit präsentierten Resultaten wird ein Modell der molekularen Architektur des RES Komplexes vorgestellt

Transfer RNA processing – from a structural and disease perspective

Transfer RNAs (tRNAs) are highly structured non-coding RNAs which play key roles in translation and cellular homeostasis. tRNAs are initially transcribed as precursor molecules and mature by tightly controlled, multistep processes that involve the removal of flanking and intervening sequences, over 100 base modifications, addition of non-templated nucleotides and aminoacylation. These molecular events are intertwined with the nucleocy- toplasmic shuttling of tRNAs to make them available at translating ribosomes. Defects in tRNA processing are linked to the development of neurodegenerative disorders. Here, we summarize structural aspects of tRNA processing steps with a special emphasis on intron-containing tRNA splicing involving tRNA splicing endonuclease and ligase. Their role in neurological pathologies will be discussed. Identification of novel RNA substrates of the tRNA splicing machinery has uncovered functions unrelated to tRNA processing. Future structural and biochemical studies will unravel their mechanistic underpinnings and deepen our understanding of neurological diseases

A dual inhibition mechanism of herpesviral ICP47 arresting a conformationally thermostable TAP complex

As a centerpiece of antigen processing, the ATP-binding cassette transporter associated with antigen processing (TAP) became a main target for viral immune evasion. The herpesviral ICP47 inhibits TAP function, thereby suppressing an adaptive immune response. Here, we report on a thermostable ICP47-TAP complex, generated by fusion of different ICP47 fragments. These fusion complexes allowed us to determine the direction and positioning in the central cavity of TAP. ICP47-TAP fusion complexes are arrested in a stable conformation, as demonstrated by MHC I surface expression, melting temperature, and the mutual exclusion of herpesviral TAP inhibitors. We unveiled a conserved region next to the active domain of ICP47 as essential for the complete stabilization of the TAP complex. Binding of the active domain of ICP47 arrests TAP in an open inward facing conformation rendering the complex inaccessible for other viral factors. Based on our findings, we propose a dual interaction mechanism for ICP47. A per se destabilizing active domain inhibits the function of TAP, whereas a conserved C-terminal region additionally stabilizes the transporter. These new insights into the ICP47 inhibition mechanism can be applied for future structural analyses of the TAP complex

Structural basis of substrate recognition by human tRNA splicing endonuclease TSEN

The heterotetrameric human transfer RNA (tRNA) splicing endonuclease (TSEN) catalyzes the excision of intronic sequences from precursor tRNAs (pre-tRNAs)1. Mutations in TSEN and its associated RNA kinase CLP1 are linked to the neurodegenerative disease pontocerebellar hypoplasia (PCH)2–8. The three-dimensional (3D) assembly of TSEN/CLP1, the mechanism of substrate recognition, and the molecular details of PCH-associated mutations are not fully understood. Here, we present cryo-electron microscopy structures of human TSEN with intron-containing pre-tRNATyrgta and pre-tRNAArgtct. TSEN exhibits broad structural homology to archaeal endonucleases9 but has evolved additional regulatory elements that are involved in handling and positioning substrate RNA. Essential catalytic residues of subunit TSEN34 are organized for the 3’ splice site which emerges from a bulge-helix configuration. The triple-nucleotide bulge at the intron/3’-exon boundary is stabilized by an arginine tweezer motif of TSEN2 and an interaction with the proximal minor groove of the helix. TSEN34 and TSEN54 define the 3’ splice site by holding the tRNA body in place. TSEN54 adapts a bipartite fold with a flexible central region required for CLP1 binding. PCH-associated mutations are located far from pre-tRNA binding interfaces explaining their negative impact on structural integrity of TSEN without abrogating its catalytic activity in vitro10. Our work defines the molecular framework of pre-tRNA recognition and cleavage by TSEN and provides a structural basis to better understand PCH in the future

Light it up: Highly Efficient Multigene Delivery in Mammalian Cells

Multigene delivery and expression systems are emerging as key technologies for many applications in contemporary biology. We have developed new methods for multigene delivery and expression in eukaryotic hosts for a variety of applications, including production of protein complexes for structural biology and drug development, provision of multicomponent protein biologics and for cell-based assays. We implemented tandem recombineering to facilitate rapid generation of multicomponent gene expression constructs for efficient transformation of mammalian cells, resulting in homogenous cell populations. Analysis of multiple parameters in living cells may require co-expression of fluorescently tagged sensors simultaneously in a single cell, at defined and ideally controlled ratios. Our method enables such applications by overcoming currently limiting challenges. Here, we review recent multigene delivery and expression strategies and their exploits in mammalian cells. We discuss applications in drug discovery assays, interaction studies and biologics production, which may benefit in the future from our novel approach