La synthèse de la coiffe en tant que nouvelle cible thérapeutique potentielle

Afin de pallier l'apparition de souches pathogènes résistantes, de nouveaux traitements aux mécanismes d'action inédits doivent être découverts. Une de ces cibles d'intérêt grandissant est la synthèse de la structure coiffe chez les ARN messagers (ARNm) eucaryotes. Cette structure est l'une des modifications co-transcriptionnelles essentielles pour augmenter la demi-vie des ARNm, promouvoir leur export du noyau vers le cytoplasme et augmenter l'efficacité de leur traduction en protéines. La synthèse de la structure coiffe (m [indice supérieur 7] GpppARN) résulte de trois activités enzymatiques séquentielles qui ajoutent la structure m[indice supérieur 7] Gppp. Initialement, une ARN triphosphatase (RTase) hydrolyse le phosphate gamma de l'ARN. Une ARN guanylyltransférase (GTase) transfert ensuite sur cet ARN un groupement GMP à partir d'un GTP. Finalement, une ARN guanine-N7 méthyltransférase (N7-MTase) vient méthyler cette guanine en position N7. L'activité enzymatique de la GTase est déterminante pour la synthèse de la structure coiffe, ce qui en fait une cible potentiellement puissante afin d'inhiber la synthèse de la structure coiffe. Certaines études ont identifié des analogues de substrat et de produit, la ribavirine et le foscarnet respectivement, comme inhibiteur de GTase. Ces produits agissent sur les différentes GTases puisqu'elles possèdent un site actif très conservés au niveau de la coordination du substrat. Pour augmenter la spécificité des inhibiteurs, il serait avantageux d'identifier des composés ciblant les régions non conservées. Dans la présente étude, la technique du criblage virtuel a permis d'analyser le potentiel d'interaction des molécules à 80 % similaires au substrat naturel avec plusieurs structures de GTases. Parmi les interactions prédites identifiées par le criblage virtuel, une de ces molécules suscitait un intérêt particulier, puisqu'il s'agissait d'un composé utilisé chez l'humain en tant qu'antiviral et immunosuppresseur, l'acide mycophénolique (MPA). L'hypothèse initiale était que ce composé pouvait potentiellement interférer dans l'activité enzymatique des GTases. Pour valider cette prédiction, des essais biochimiques ciblant la réaction complète et les étapes intermédiaires de la GTase de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae ) ont été utilisées pour définir l'effet du MPA sur la cinétique de cette GTase. En effet, la réaction de GTase se déroule en deux temps : premièrement, une molécule de GTP est hydrolysée par l'enzyme pour former du GMP, lequel est lié de façon covalente à l'enzyme, et deuxièmement, cette molécule de GMP est transférée sur un ARN diphosphorylé. Ces essais ont confirmé l'interaction prédite par le criblage virtuel. En utilisant cette approche, nous démontrons que le MPA peut inhiber la réaction de GTase en prévenant le transfert catalytique du nucléotide GMP sur l'ARNm accepteur. En ce sens, le MPA représente un nouveau type d'inhibiteur d'ARN guanylyltransférase qui inhibe la deuxième étape de l'activité catalytique. Puisque les résultats laissaient présager une inhibition non compétitive, il fallait confirmer que le MPA n'était pas reconnu par l'enzyme comme substrat. Pour ce faire, la technique de l'électrophorèse par capillarité a montré que l'inhibiteur ne formait pas de lien covalent avec l'enzyme. De plus, nous démontrons qu'une culture de Saccharomyces cerevisiae qui croit en présence de MPA dénote une quantité moindre d'ARNm possédant une coiffe. Finalement, des essais biochimiques démontrent que le composé peut également inhiber des enzymes de la même famille que les GTases utilisant des substrats différents : les ligases à ADN. Le MPA inhibe la deuxième étape de la réaction enzymatique d'une ligase, soit le transfert du nucléotide sur l'oligonucléotide. Ce mémoire vise donc à présenter un aperçu du mécanisme d'inhibition de l'ARN guanylyltransférase par un composé allostérique. Nous montrons qu'il est possible de réduire la synthèse de la structure coiffe en affectant les changements conformationnels de cette enzyme

Global profiling of alternative RNA splicing events provides insights into molecular differences between various types of hepatocellular carcinoma

Protein families encoded by transcripts that are differentially spliced in various types of HCC. Table S2. Bioinformatical prediction of functional changes caused by some of ASEs identified. Table S3. List of tumor suppressors for which AS is dysregulated in various types of HCC. Table S4. List of oncogenes for which AS is dysregulated in various types of HCC. Table S5. List of kinases for which AS is dysregulated in various types of HCC. Table S6. List of transcription factors for which AS is dysregulated in various types of HCC. Table S7. List of genes for which AS is dysregulated in all types of HCC. Table S8. List of genes uniquely dysregulated in HBV-associated HCC. Table S9. List of genes uniquely dysregulated in HCV-associated HCC. Table S10. List of genes uniquely dysregulated in HBV&HCV-associated HCC. Table S11. List of genes uniquely dysregulated in virus-free HCC. Figure S1. Characterization of splicing mysregulation in HCC. Figure S2. Characterization of ASEs that are modified in HBV- and HCV-associated HCC. Figure S3. AS modifications in transcripts encoded by kinases and transcriptions factores in HBV- and HCV-associated HCC. Figure S4. Global profiling of ASE modifications in both HBV&HCV-associated HCC and virus-free-associated HCC. Figure S5. RNA splicing factors in HCC. Figure S6. Modifications to AS of 96 transcripts in response to knockdown of splicing factors with specific siRNAs (PDF 6675 kb

Virtual High-Throughput Screening Identifies Mycophenolic Acid as a Novel RNA Capping Inhibitor

The RNA guanylyltransferase (GTase) is involved in the synthesis of the m7 Gppp-RNA cap structure found at the 59 end of eukaryotic mRNAs. GTases are members of the covalent nucleotidyl transferase superfamily, which also includes DNA and RNA ligases. GTases catalyze a two-step reaction in which they initially utilize GTP as a substrate to form a covalent enzyme-GMP intermediate. The GMP moiety is then transferred to the diphosphate end of the RNA transcript in the second step of the reaction to form the Gppp-RNA structure. In the current study, we used a combination of virtual database screening, homology modeling, and biochemical assays to search for novel GTase inhibitors. Using this approach, we demonstrate that mycophenolic acid (MPA) can inhibit the GTase reaction by preventing the catalytic transfer of the GMP moiety onto an acceptor RNA. As such, MPA represents a novel type of inhibitor against RNA guanylyltransferases that inhibits the second step of the catalytic reaction. Moreover, we show that the addition of MPA to S. cerevisiae cells leads to a reduction of capped mRNAs. Finally, biochemical assays also demonstrate that MPA can inhibit DNA ligases through inhibition of the second step of the reaction. The biological implications of these findings for the MPA-mediated inhibition of members of the covalent nucleotidyl superfamily are discussed

Mycophenolic acid inhibits the RNA guanylyltransferase activity.

<p>(<b>A</b>) Molecular structure of mycophenolic acid (MPA). (<b>B</b>) Increasing concentrations of MPA inhibit the complete RNA guanylyltransferase reaction. A standard GTase assay in which the purified enzyme (1 µM) was incubated with both [alpha-³²P]GTP and a 5′-diphosphate acceptor RNA was performed in the presence of increasing concentrations of MPA. The reaction products were analyzed on a denaturing polyacrylamide gel and quantified (<i>right side of the panel</i>). (<b>C</b>) MPA is not a potent inhibitor of the first step of the GTase reaction. The formation of the enzyme-GMP covalent intermediate was monitored by incubating the purified enzyme (1 µM) in the presence of [alpha-³²P]GTP and increasing concentrations of MPA. The radiolabeled covalent enzyme-GMP complex was then visualized by autoradiography following electrophoresis on a denaturing 12.5% polyacrylamide gel. The radiolabeled enzyme-GMP complex was quantified by phosphorimaging (<i>right side of the panel</i>). (<b>D</b>) The second step of the GTase reaction is inhibited by MPA. The transfer of the GMP moiety onto an acceptor RNA was evaluated by pre-incubating the enzyme (1 µM) with [alpha-³²P]GTP (10 mM) to ensure formation of the radiolabeled covalent enzyme-GMP complex, followed by the addition of the acceptor 5′-diphosphate RNA (3 µM) in the presence of MPA. Formation of the radiolabeled capped GpppRNA was monitored following electrophoresis on a denaturant polyacrylamide gel. The radiolabeled GpppRNA was then quantified by phosphorimaging (<i>right side of the panel</i>).</p

Binding of MPA to the enzyme-GMP complex inhibits the interaction with RNA.

<p>(<b>A</b>) The enzyme-GMP complex was incubated with a radiolabeled RNA substrate (3 µM) of 81 nucleotides in the presence of increasing concentrations of MPA. UV-cross-linking assays were performed to monitor the binding of radiolabelled RNA to the enzyme-GMP complex and visualized by SDS-PAGE analysis and autoradiography. (<b>B</b>) The reaction products were quantified by phosphorimaging.</p

MPA inhibits RNA capping in <i>S. cerevisiae</i> cells.

<p>Primer extension assays were performed with a 5′ P³²-labeled 18-mer oligonucleotide complementary to the 5′ region of the <i>SSA1</i> mRNA. The oligonucleotide was annealed to total mRNAs extracted from cells that were grown in the absence (<i>−MPA</i>) or presence (<i>+MPA</i>) of 500 µg/ml MPA for 3 h, and extended with reverse transcriptase. The primer extension reactions were analyzed by electrophoresis through a 8% polyacrylamide gel containing 7 M urea in TBE and visualized by autoradiography. Control P³²-labeled RNA transcripts of 74 (<i>C1</i>) and 73 (<i>C2</i>) nucleotides were run in parallel. The positions and sizes (in nt) of the size markers are indicated on the <i>left</i>.</p