Improvement of recombinant antibodies production in the diatom Phaeodactylum tricornutum

Le marché des anticorps monoclonaux (mAbs) est en plein essor en raison de leur utilisation dans le traitement de nombreuses maladies chroniques et inflammatoires. Cependant, les systèmes de production utilisés présentent des inconvénients qui incitent la communauté scientifique à se tourner vers de nouvelles alternatives telles que les microalgues. Des études récentes ont démontré la capacité de la diatomée P. tricornutum à produire des mAbs fonctionnels dirigés contre certains virus, mais les rendements de production obtenus sont trop faibles pour prétendre à un passage à l’échelle industrielle. Afin d’étendre la preuve de concept de la production de mAbs chez la diatomée P. tricornutum, nous avons focalisé nos travaux sur la production d’un anticorps anti-HER2 en utilisant un nouveau design de vecteur. Malheureusement, un problème de contamination détecté en fin de thèse ne nous permet pas aujourd’hui de conclure définitivement sur l’efficacité de ces vecteurs pour la production de mAbs anticancéreux fonctionnels chez P. tricornutum. La deuxième partie de ce travail s’est concentrée sur le développement de différentes approches afin d’augmenter le rendement de production de mAbs chez cette diatomée. Nous avons d’abord caractérisé de nouveaux promoteurs de gènes exprimés dans des conditions de faible salinité en se basant sur des données de transcriptomiques précédemment publiées par le laboratoire. Sur les 28 promoteurs testés, nous avons montré que 13 d’entre eux étaient capables de conduire à l’expression de la protéine rapportrice eGFP. Parmi eux, nous avons démontré que le promoteur VOC est une alternative prometteuse au promoteur NR, utilisé jusqu’à présent pour la production de mAbs chez P. tricornutum. En parallèle, nous avons identifié des éléments spécifiques du vecteur d’expression permettant une augmentation du rendement de sécrétion des mAbs dans le milieu de culture de la diatomée. Nous avons mis en évidence que l’utilisation du terminateur du gène fcpA était plus efficace pour augmenter le rendement de production comparativement aux terminateurs endogènes associés aux promoteurs testés. De plus, nous avons montré que l’utilisation de peptides signaux hétérologues augmentait de façon surprenante la sécrétion des mAbs dans le milieu de culture par rapport au peptide signal de la protéine endogène HASP1, la protéine la plus abondamment sécrétée par la diatomée. Dans l'ensemble, ces résultats contribuent à la découverte de nouveaux outils génétiques et d'éléments du vecteur d’expression qui permettent d'augmenter la quantité de mAbs sécrétés et accumulés dans le milieu de culture de P. tricornutum.The market share of monoclonal antibodies (mAbs) is expanded rapidly due to their increasing use in the treatment of many chronic and inflammatory diseases. However, the current production systems present several drawbacks that are prompting the scientific community to explore new alternatives such as microalgae. Recent studies have shown the ability of the diatom P. tricornutum to produce functional mAbs directed against viruses, but the production yields are too low for the production at an industrial scale. In order to extend the proof of concept, we attempted to produce an anti-Her2 antibody in P. tricornutum using a new vector design. Unfortunately, a contamination problem detected at the end of the thesis does not allow us to definitively conclude on the efficacy of these vectors for the production of functional anti-cancer mAbs in P. tricornutum. The second part of this work focused on the development of different approaches to increase the mAbs production yield in this diatom. We first characterised new promoters of genes overexpressed under low salinity conditions based on transcriptomic data previously published by the laboratory. Of the 28 promoters tested, we showed that 13 of them were capable of driving the expression of the eGFP reporter protein. Among them, we demonstrated that the VOC promoter is a promising alternative to the NR promoter used until now for the production of mAbs in P. tricornutum. In parallel, we identified specific elements of the expression vector that allow an increase in the secretion yield of mAbs in the diatom culture medium. We also demonstrated that the use of the fcpA gene terminator was more effective in increasing the production yield compared to the endogenous terminators associated with the tested promoters. Furthermore, we showed that the use of heterologous signal peptides surprisingly increased the secretion of mAbs into the culture medium compared to the signal peptide of HASP1, the most abundant secreted endogenous protein. Overall, these results contribute to the discovery of new genetic tools and vector elements that allow to increase the amount of mAbs secreted and accumulated in P. tricornutum culture medium

Transcriptomic analyses unravel differential expression of genes involved in the N-glycosylation pathway of Phaeodactylum tricornutum ecotypes

International audienc

Adaptation de bactéries entériques pathogènes et/ou antibiorésistantes sur des feuilles de salade

International audienc

Adaptation de bactéries entériques pathogènes et/ou antibiorésistantes sur des feuilles de salade

International audienc

Adaptation of enteric pathogenic bacteria on salad leaves and involvement of conjugative multiple-antibiotic resistance plasmids

International audienc

Adaptation of enteric pathogenic bacteria on salad leaves and involvement of conjugative multiple-antibiotic resistance plasmids

International audienc

Improvement of monoclonal antibodies production in the diatom using new promoters

International audienc

Towards understanding the extensive diversity of protein N‐glycan structures in eukaryotes

International audienceN-glycosylation is an important post-translational modification of proteins that has been highly conserved during evolution and is found in Eukaryota, Bacteria and Archaea. In eukaryotes, N-glycan processing is sequential, involving multiple specific steps within the secretory pathway as proteins travel through the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. In this review, we first summarize the different steps of the N-glycan processing and further describe recent findings regarding the diversity of N-glycan structures in eukaryotic clades. This comparison allows us to explore the different regulation mechanisms of N-glycan processing among eukaryotic clades. Recent findings regarding the regulation of protein N-glycosylation are highlighted, especially the regulation of the biosynthesis of complex-type N-glycans through manganese and calcium homeostasis and the specific role of transmembrane protein 165 (TMEM165) for which homologous sequences have been identified in several eukaryotic clades. Further research will be required to characterize the function of TMEM165 homologous sequences in different eukaryotic clades

Towards understanding the regulation of the N-glycosylation pathway in regards to the huge diversity of the N-glycan structures identified in Eukaryotes

International audienc