Participación del glutamato en la adaptación osmótica de Pseudomonas aeruginosas

In this work is intended to evaluate the action of the glutamate as exogenous osmoprotectant in Pseudomonas aeruginosa grown under osmotic stress conditions. The addition of exogenous glutamate, starting from a concentration 0,1mM, confers osmotic tolerance when this bacterium grows in presence of NaCl, with glucose and ammonium as carbon and nitrogen sources, respectively. The effect shows for the decrease significatively the lag period of growth, without variations in the time of generation. Contrary to the observed behavior with glutamate, the addition the choline like external osmoprotectant, it diminishes both parameters of growth. If glutamate and choline are simultaneously present in growth medium can be observed a synergist effect, P.aeruginosa incorporates both compounds with decrease of the lag period growth and the time of generation. It demonstrates that these osmoprotectants is not excluded mutually. In P. aeruginosa the glutamate uptake responds to a hyper-osmotic upshock, being dependent of the energetic state of the cell and of the synthesis of new proteins. The study of intracellular metabolites obtained after incubating the cells under conditions hyperosmotic in presence of glutamate, it showed that, once incorporate, this metabolite doesn't accumulate as itself. The analysis of the intracellular contained for HPLC and 13C-NMR reveals the presence of N-Acetylglutaminylglutamine amide (NAGGA) and it confirms that the exogenous glutamate acts as precursor of this dipeptide. The identification for 13C-NMR of the accumulated compatible solutes in stressed cells of P. aeruginosa grows until logarithmic phase under hiperosmotic conditions with the addition of 1 mM glutamate; it showed the presence of glutamate, NAGGA and trehalose. According to these results is possible to attribute the glutamate a double function: to act as a chemical mediator and as a genuine osmolite.En este trabajo se propuso evaluar la acción del glutamato como osmoprotector exógeno en cultivos de Pseudomonas aeruginosa crecidos en condiciones hiperosmolares. La adición de glutamato exógeno, a partir de una concentración 0,1mM, confiere osmoprotección cuando esta bacteria crece en presencia de NaCl, con glucosa y amonio como fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente. El efecto se pone de manifiesto por la disminución del tiempo de latencia, sin variaciones en el tiempo de generación. A diferencia del comportamiento observado con glutamato, la adición de colina como osmoprotector externo, disminuye ambos parámetros de crecimiento. Si glutamato y colina se suplementan simultáneamente a cultivos hiperosmolares, P.aeruginosa incorpora ambos compuestos y se observa un efecto sinérgico, con disminución del tiempo de latencia y el tiempo de generación. Ello demuestra que estos osmoprotectores no se excluyen mutuamente. En P. aeruginosa el transporte de glutamato responde a la alta fuerza osmótica, siendo dependiente del estado energético de la célula y de la síntesis de nuevas proteínas. El estudio de metabolitos intracelulares obtenidos luego de incubar las células en condiciones hiperosmolares en presencia de glutamato, mostró que, una vez incorporado, este metabolito no se acumula como tal. El análisis del contenido intracelular por HPLC y 13C-NMR revela la presencia de N-acetilglutaminil-glutamina amida (NAGGA) y confirma que el glutamato adicionado exógenamente actúa como precursor de este dipéptido. La identificación por 13C-NMR de los solutos compatibles acumulados cuando P. aeruginosa crece hasta fase logarítmica en condiciones hiperosmolares con glutamato 1 mM, mostró la presencia de glutamato, NAGGA y trealosa. En base a estos resultados es posible atribuir al glutamato una doble función: actuar como un mediador químico y como un osmolito genuino

Estudios de la actividad antimicrobiana de cuatro especies del género Baccharis

Four species from Baccharis genus (Compositae) are assessed due to antimicrobial activity against eight bacterial species. The modified Kirby Bauer method was used in the assay. The methalonic extracts from B. articulata, B. soliafolia, B. pingraea showed an inhibitory halo in comparison with Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus epidermidis. None of the studied species showed activity against Gram negative bacteria. B. spartioides displayed no antimicrobial activity against none of the investigated bacterial species.El presente estudio evaluó en cuatro especies del género Baccharis (Compositae) la presencia de actividad antimicrobiana frente a ocho especies bacterianas. El método utilizado en el ensayo fue el Kirby Bauer modificado. Los extractos metanólicos de B. articulata, B. soliafolia, B. pingraea presentaron halo de inhibición frente a Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Staphylococcus epidermidis. Ninguna de las especies investigadas presento actividad frente a bacterias Gram negativo. B. spartioides no demostró actividad antimicrobiana frente a ninguna de las especies bacterianas investigadas

Evaluación de la capacidad de formar biofilm de micobacterias ambientales aisladas de agua de natatorios públicos y de agua de lluvia de la ciudad de General Pico

La persistencia de micobacterias ambientales (MA) en los hábitats modificados por el hombre, entre los cuales se encuentran los natatorios de uso recreacional y/o terapeúticos se debe a su oligotrofia, diversidad nutricional, resistencia a los desinfectantes y fundamentalmente a la formación de biofilm. Estos factores actuarían como agentes selectivos, favoreciendo la proliferación y dominio final de las MA en estos hábitats respecto a otros microorganismos presentes en el agua. Este incremento de micobacterias constituye una potencial fuente de infección principalmente para los individuos inmunocomprometidos. Es sabido que las bacterias se hallan en la naturaleza en dos formas o estados: creciendo en biofilms (99%) y en forma planctónica o de libre flotación (1%). Es clara la ventaja que significa para las micobacterias, ya sean patógenas o ambientales, la capacidad para colonizar superficies (animadas o inanimadas) mediante la formación de biofilm, debido a que éste les brinda mayor disponibilidad de nutrientes y protección contra factores ambientales naturales y artificiales. Teniendo en cuenta este concepto se formuló la 2º hipótesis del proyecto que tiene como objetivo: Evaluar la capacidad de formar biofilm in vitro de las cepas de MA aisladas de distintas fuentes de agua. Para valorar la capacidad de formar biofilm se sembraron inóculos estandarizados de las MA en policubetas estériles de PVC de 96 pocillos (BectonDickinson). Se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se adicionó el medio de cultivo Middlebrook 7H9 (MB) con glicerol. Las policubetas se taparon y se incubaron a 30 °C por 20 días. Para medir la formación del biofilm, los pocillos se lavaron con agua estéril, se tiñeron con cristal violeta al 1% y se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron con agua y se secaron sobre papel secante. El colorante incorporado al biofilm se resuspendió en etanol:acetona (70:30). La cuantificación se realizó midiendo densidad óptica en un lector de microplacas (Kayto RT-2100C) a 630 nm. Se destinaron pocillos con el medio de cultivo MB con glicerol sin suspensión bacteriana como control negativo. Se utilizó a Mycobacterium smegmatis (cepa patrón) como control positivo. Los resultados mostraron que tanto los aislamientos de MA en agua de natatorios (9 cepas ensayadas de 16 aislamientos totales) como los correspondientes al agua de lluvia (4 cepas ensayadas de 7 aislamientos) mostraron capacidad para desarrollar biofilm in vitro. Las MA de agua de natatorio: Mycobacterium gordonae, Mycobacterium houstonense, Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium mucogenicum (pertenecientes a los clados M. gordonae, M. fortuitum y M. mucogenicum, respectivamente) formaron biofilm mostrando consistencia débil a moderada (rango de absorbancias: 0,035 - 0,556). El biofilm formado por las MA ensayadas del agua de lluvia: Mycobacterium frederikbergense y Mycobacterium holsaticum (pertenecientes a los clados M. neoaurum y M. komossense) y dos cepas no tipificadas, varió desde consistencia débil a moderada-fuerte (rango de absorbancias: 0,160 - 0,738). Los resultados obtenidos hasta la fecha guían a concluir que la persistencia de las MA en los natatorios desinfectados con altas concentraciones de cloro podría asociarse a la capacidad de las mismas para formar biofil

Utilization of molecular and conventional methods for the identification of nontuberculous mycobacteria isolated from different water sources

Background: The environment is the nontuberculous mycobacteria (NTM) reservoir, opportunistic pathogens of great diversity and ubiquity, which is observed in the constant description of new species capable of causing infection. Since its introduction, molecular methods are essential for species identification. Most comparative studies between molecular and conventional methods, have used isolated strains from clinical samples. Methods: The aim of this study was to evaluate the usefulness of molecular methods, especially the hsp65-PRA (PCR-Restriction Enzyme Analysis), and biochemical tests in the identification of NTM recovered from water of different origins, using the sequencing of 16S rRNA and hsp 65 genes as assessment methods of the previous ones. Species identification was performed for all 56 NTM isolates what were recovered from 32 (42.1%) positive water samples, using conventional phenotypic methods, hsp65-PRA, partial sequencing of 16S rRNA and sequencing of hsp 65 genes. Results: Phenotypic evaluation and hsp65-PRA were concordant with 23 (41.1%) isolates. Also, the PRA was concordant with 16 (28.6%) and 27 (48.2%) isolates, with the partial sequencing of 16S rRNA and sequencing of hsp 65 genes, respectively. It is considered that the 19.6% (n = 11) could not be identified. Conclusion: Identification of NTM environmental isolates to the species level, especially when they are pigmented and fast-growing, both the analysis of the restriction patterns obtained by PRA and the sequencing of the 16S rRNA and hsp 65 genes are insufficient by themselves. Although they are demanding and time-consuming, biochemical tests are very useful to support data obtained by molecular methods.Instituto de BiotecnologíaFil: Tortone, Claudia Andrea. Universidad Nacional de La Pampa. Facultad de Ciencias Veterinarias; ArgentinaFil: Zumarraga, Martin Jose. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Gioffre, Andrea Karina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Oriani, Delia Susana. Universidad Nacional de La Pampa. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentin

Micobacterias ambientales: componentes estructurales y no estructurales que evidencian su potencial como patógenas oportunistas / Environmental mycobacteria: structural and non structural components that demonstrate its potential as opportunistic pathogen

Las infecciones producidas por micobacterias ambientales (MA) han ido cambiando a través del tiempo. Históricamente la mayoría de dichas infecciones se manifestaban en individuos inmunocomprometidos o en personas de edad avanzada con alguna afección pulmonar predisponente. Posteriormente se identificaron como una complicación común de pacientes infectados con HIV. En la actualidad y en todo el mundo se registran casos en pacientes inmunocompetentes sin una aparente causa predisponente, relacionados en general a procedimientos quirúrgicos o estéticos. Además, junto con el aumento en la frecuencia de aislamientos de MA, se van describiendo nuevas especies susceptibles de producir patología en humanos. Las micobaterias pueden ser agrupadas de acuerdo a su nivel de virulencia o significancia clínica. Algunas especies son consideradas de transición entre patógenas y saprófitas, definidas como patógenas oportunistas. No está claro qué particularidad lleva a que una MA saprófita pueda transformarse en patógena y a su vez que desencadene infección en huéspedes inmunocompetentes. En esta revisión se describen los componentes estructurales y no estructurales considerados posibles factores de patogenicidad más relevantes de las MA, que intervienen mayoritariamente en la interacción microorganismo-célula fagocítica. También se hace referencia a nuevos descubrimientos in vitro dentro de la patogenia del género Mycobacterium, que tratan de elucidar diferencias y similitudes con las micobacterias patógenas obligadas, más específicamente con M .tuberculosis 

Valoración de cuatro métodos de descontaminación para la recuperación de Micobacterias ambientales de diferentes nichos ecológicos /Analysis of four methods of decontamination to recover environmental mycobacterium in different ecological niches

When attempting to recover myco­bacterium through lab or environmental sam­ples it´s necessary to apply a decontamination method that reduces the accompanying micro­biota. It is possible to apply drastic decontami­nation methods due to the fact that mycobacte­rium presents a complex wall structure. There are several proposed methods, considering that the ideal method is the one that reduces accompanying microbiota without affecting the number of existing mycobacterium. The ob­jective of this study was to determine decimal reduction of a mycobacterium strain suspen­sion applying the decontamination methods proposed for soil samples, recreational water, tap water and fecal material. A mixed inoculum of mesophilic bacterium was determined (B M) commonly isolated from the environment and another one with a Mycobacterium porcinum strain recovered from tap water. Both inoculums were diluted until a suspension equivalent to a 1 tube of the Mc Farland scale was reached. The real number of bacterium was quantified using the dilution method with base 10. At the same time, three experiments were made to demonstrate decimal reduction when apply­ing different decontaminations methods when trying to recover mycobacterium from soil (Ii­vanainen, 1995); wetlands (Leite et al., 1989); tap water (Engel et al., 1980); and fecal material (Stabel et al., 1997). Results obtained in this study demonstrated that the Leite et al. (1989) and the Stabel et al. (1997) methods reduced the total number of contaminating bacterium while the number of Mycobacterium porcinum were reduced by 3 and 4 log. Independently ap­plying the methods of Iivanainen (1995) y Engel et al. (1980) reductions of 4 log were obtained in BM contaminants while in the Mycobacterium porcinum strain the reduction varied between 2,5 log and 1 log respectively. It is important to consider the mycobacterium reduction by each different method to correct mycobacterium count numbers in the environmental samples and also so that certain environments are not included as possible habitats of mycobacterium when they are not recovered by conventional methods due to the fact that they may be under the determined reduction valueCuando se intenta recuperar micobacterias a partir de muestras clínicas o del medio ambiente es necesario emplear métodos de descontaminación que disminuyan la microbiota acompañante. Es posible aplicar métodos drásticos de descontaminación debido a que las micobacterias presentan una compleja estructura de pared. Existen varios métodos propuestos, considerando como método ideal aquel que reduzca al máximo la microbiota acompañante sin disminuir o afectar el número de micobacterias presentes. El objetivo de este trabajo fue determinar la reducción decimal de una suspensión de una cepa de micobacterias ambientales aplicando los métodos de descontaminación propuestos para muestras de suelo, aguas recreacionales, agua de red, y materia fecal. Se determinó un inóculo mixto de bacterias mesófilas (BM) aisladas comúnmente del medio ambiente y otro con una cepa de Mycobacterium porcinumrecuperada de agua de red. Ambos inóculos se diluyeron hasta alcanzar una suspensión equivalente al tubo 1 de la escala de Mc Farland. Se cuantificó el número real de bacterias siguiendo el método de diluciónen base 10. Paralelamente se efectuaron tres experiencias para demostrar la reducción decimal al aplicar los distintos métodos de descontaminación cuando se intenta recuperar micobacterias desde suelo (Iivanainen, 1995), humedales (Leite et al., 1989); agua de red (Engel et al., 1980); y materia fecal (Stabel et al., 1997). Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que los métodos de Leite et al. (1989)y de Stabel et al. (1997) redujeron totalmente el número de bacterias contaminantes mientras que en M. porcinum se redujo el número en 3 y 4 log. Aplicando independientemente los métodos deIivanainen (1995) y Engel et al. (1980) se obtuvieron reducciones de 4 log en las BM contaminantes, mientras que para la cepa de M. porcinum la reducción osciló en 2,5 log y 1 log respectivamente. Es importante considerar la reducción del número de micobacterias que ocasionan los diferentes métodos para corregir los valores de los recuentos micobacterianos en las muestras ambientales y también para no excluir ciertos ambientes como posibles hábitas de micobacterias cuando éstas no se recuperan por los métodos convencionales ya que pueden estar debajo del valor de reducción determinado DOI:http://dx.doi.org/10.19137/cienvet2014162

Stapylococcus aureus sensible a extractos metanólicos obtenido de plantas nativas de la provincia de La Pampa,Argentina

The massive and indiscriminate use of antimicrobials brings abaut some negative consequences like the generation of resistant bacterial strains. Considering the need to get new therapeutic alternatives and having presented the idea that plants are active constituents reservoir not totally studiend yet, a primary screening was performed in 80 of the vegetable extracts coming from wild plants collected in different geographic areas in the province of La Pampa. The purpose was to detect new sources of animicrobial agents, 41.25% of the vegetable species showed an inhibition zone against Staphylococcus aureusEl uso masivo e indiscriminado de los antimicrobianos trae consigo algunas consecuencias negativas como es la generación de cepas bacterianas resistentes. Considerando la necesidad de encontrar nuevas alternativas terapéuticas y teniendo en cuenta que las plantas son un reservorio de principios activos aun no investigados en su totalidad, se realizó un estudio primario de 80 extractos vegetales provenientes de plantas silvestres recolectadas en diferentes áreas geográficas de la provincia de La Pampa con el objeto de detectar nuevas fuentes de agentes antimicrobianos. El 41,25% de las especies vegetales presentaron halo de inhibición frente a Staphylococcus aureu

Diversidad de especies de micobacterias no tuberculosas aisladas en ambientes acuáticos de la ciudad de General Pico, La Pampa, Argentina = Species diversity of non-tuberculous mycobacteria isolated from aquatic environments of General Pico city, Province of La Pampa (Argentina)

Las micobacterias no tuberculosas (MNT) no solo se estudian por su importancia como patógenos oportunistas, sino también por sus aplicaciones en biotecnología y biorremediación. Nuestro objetivo fue determinar la presencia de micobacterias en los distintos hábitats acuáticos de la ciudad de General Pico (provincia de La Pampa), así como su diversidad. Los porcentajes de muestras positivas a micobacterias fueron los siguientes: 37,5% en el sistema de distribución de agua de red, 32,6% en el acuífero que abastece dicho sistema, 36,8% en el agua proveniente de las precipitaciones, 53,1% en los humedales del área de influencia, 80% en los natatorios cubiertos y 33,3% en las fuentes decorativas ubicadas en plazas públicas. De los 90 aislamientos de MNT obtenidos el 8,9% no logró ser identificado a nivel de especie con los métodos utilizados, que incluyeron pruebas fenotípicas y métodos moleculares. Las especies más frecuentemente aisladas fueron Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium gordonae. Algunas especies identificadas han sido reportadas en casos de micobacteriosis en nuestro país, entre ellas M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. vaccae, M. lentiflavum y M. nonchromogenicum. No se aislaron MNT en muestras de agua de red con concentraciones de cloro activo residual mayores de 0,8 mg/l, mientras que en los natatorios la presencia de hasta 1,5 mg/l de cloro activo residual no fue una limitante para la proliferación de estos microorganismos. Se puede considerar que la incidencia de micobacterias en los ambientes acuáticos de General Pico es cercana al 35%, y que la presencia de estos microorganismos y su diversidad se ve afectada por el contacto con el hombre y sus actividades, como así también por la existencia de vida animal.Non-tuberculous mycobacteria (NTM) are studied not only for their importance as emerging opportunistic pathogens but also for their applications in biotechnology and bioremediation. Our aim was to determine the occurrence and diversity of mycobacteria in different aquatic habitats of General Pico city, Province of La Pampa. The percentage of samples with positive cultures for mycobacteria were the following: 37.5% recovered from the water supply distribution system; 32.6% from the aquifer that supplies water to the distribution system; 36.8% from rain water; 53.1% from the two wetlands in the area of influence; 80% from indoor swimming pools; and 33.3% from water fountains in downtown public squares. Of the 90 NTM isolates, 8.9% could not be identified at the species level with any of the used methods, phenotypic tests and molecular methods. Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium gordonae were the most frequently isolated species. Some of the identified species such as, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. vaccae, M. lentiflavum and M. nonchromogenicum, have been reported in cases of mycobacteriosis in Argentina. Mycobacteria with values higher than 0.8 mg/ml of residual active chlorine were not recovered from the drinking water supply network, whereas in the swimming pools the presence of up to 1.5 mg/l was not a constraint. Based on our results, the presence of mycobacteria in aquatic environments is close to 35% and their occurrence and diversity is affected both by contact with man and his activities as well as by the existence of animal life.Instituto de BiotecnologíaFil: Tortone, Claudia Andrea. Universidad Nacional de La Pampa. Facultad de Ciencias Veterinarias. Cátedra de Bacteriología y Micología; ArgentinaFil: Oriani, Delia Susana. Universidad Nacional de La Pampa. Facultad de Ciencias Veterinarias. Cátedra de Bacteriología y Micología; ArgentinaFil: Staskevich, Ana Sandra. Universidad Nacional de La Pampa. Facultad de Ciencias Veterinarias. Cátedra de Bacteriología y Micología; ArgentinaGil: Gino, Lilia Mabel. Universidad Nacional de La Pampa,. Facultad de Ciencias Veterinarias. Cátedra de Parasitología y Enfermedades Parasitarias; ArgentinaFil: Marfil, Maria Jimena. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Nava Vargas, Alejandro. Universidad Autónoma de Querétaro; MéxicoFil: Zumarraga, Martin Jose. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentin