Rol de las proteínas de reconocimiento de peptidoglicanos (PGRPs) en el sistema inmune innato

Fil: Todone, Marcos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaLa RI innata es la primera barrera de defensa de un organismo. Entre los mecanismos implicados en esta respuesta se destaca el reconocimiento de productos conservados de los microorganismos (LPS, las secuencias de ADN -CpG, PGN, etc.) denominados genéricamente patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Los PGNs interactúan con factores humorales (lisozima, CD14 soluble) y celulas (macrófagos y linfocitos) del hospedador induciendo la producción de citoquinas responsables de las manifestaciones clínicas en infecciones (fiebre, inflamación, etc.). Las PGRPs son proteínas de reconocimiento de PAMPs que unen (como el CD14 o el TLR) y en ciertos casos hidrolizan (como la lisozima) los PGNs presentes en la pared bacteriana. Es por ello que estas moléculas serían muy importantes a la hora de montar una defensa contra las infecciones bacterianas y, se encuentran altamente conservadas desde los insectos hasta los mamíferos. Estas se agrupan en tres clases: PGRP-S (short) (19-20 kDa), PGRP-I (intermédiate), (40-45 kDa) y PGRP-L (long), (30-90 kDa). En los seres humanos se expresan 4 PGRPs distintas denominadas PGRP-S, PGRP-L, PGRP-I? y PGRP-I? también nombradas como PGLYRP-1, PGLYRP-2, PGLYRP-3 y PGLYRP-4, respectivamente. Actualmente, las funciones de PGRPs en mamíferos son mucho menos entendidas que la de los insectos y hay poca certeza sobre que células expresan PGRPs. PGRP-S ha sido implicada en la destrucción intracelular de bacterias por PMNs, pero no se la detectó en LB, LT, ni en monocitos. Se detectó la presencia de PGRP-I? y de PGRP-I? en células epiteliales y PGRP-L, la única con función enzimática, en el hígado o los LT. Menos se sabe aún acerca de los mecanismos que emplean para comunicar la presencia de bacterias. \nCon el objetivo de estudiar el rol de estas proteínas en la RI innata, expresamos, replegamos in vitro y purificamos con un alto grado de pureza diferentes PGRP humanas en forma recombinante (PGRP-S, PGRP-I?C y PGRP-I?N) obteniendo rendimientos de proteína correctamente plegada y purificada de aproximadamente 1-2 mg/L cultivo. Con ellas obtuvimos antisueros policlonales específicos para cada una de las PGRPs, los cuales no demostraron reactividad cruzada con lisozima ni con otras PGRPs, que fueron utilizados como herramientas biológicas para la detección de las mismas. Observamos que las PGRPs recombinantes dimerizaban por la formación de puentes disulfuro intermoleculares y demostramos que estos dímeros son funcionalmente activos, ya que son capaces de unir bacterias y PGNs. \nDeterminamos la presencia en saliva y en suero de PGRP-S sin embargo ni PGRP-I? ni PGRP-I? fueron detectadas en ninguna de las muestras estudiadas. Por otro lado, comprobamos Universidad de Buenos Aires \n90 \n\nla existencia de dímeros de PGRP-S en PMN humanos y observamos que se secretaban. Comprobamos que los dímeros se generan por la formación de puentes disulfuro intermoleculares sin perder su funcionalidad. Como se observara en el suero, los dímeros de PGRP-S estarían formados por la oxidación de Cys libres en la superficie del monómero ya que es sensible a la reducción con DTT. También detectamos PGRP-S en monocitos y PMN mientras que PGRP-I? fue detectada en células epiteliales alveolares. \nLas PGRPs de mamíferos están descritas como proteínas solubles que actuarían como un puente entre el reconocimiento de PGN y la inducción de señales intracelulares, por lo que tendrían al menos dos sitios de interacción, uno para interactuar con el PGN y otro para hacerlo con proteínas efectoras del hospedador. Observamos que todas las PGRPs producidas no solo se unen a la superficie de los monocitos/macrófagos, sino que también, son endocitadas por estas células. No detectamos cambios al repetir los ensayos de endocitosis en presencia de Wortmanina en los cultivos, lo que sugiere que la macropinocitosis no jugaría un rol preponderante en la internalización de estas proteínas. Por otro lado, comprobamos que las PGRPs incrementan los niveles de expresión de NF-?B con respecto a los controles así como también lo hacen los complejos PGRP-PGN respecto a los controles de células tratadas con PGN, lo que sugeriría la existencia de un receptor celular que al interactuar con las PGRPs comunicaría la presencia de bacterias o fragmentos de PGN bacterianos. Sin embargo todos los intentos de co-precipitar este posible receptor no fueron exitosos. \nEn principio se observó que PGRP-S de origen murino y humano poseía acción bacteriostática mientras que la de origen bovino era bactericida, pero posteriormente, se demostró que si estaban glicosiladas podían actuar como bactericidas sobre ciertas especies bacterianas. Si bien observamos que las PGRPs aumentaban el daño en las membranas de las bacterias, no detectamos efectos bactericidas ni bacteriostáticos, sin embargo, la interacción de las PGRPs con la superficie de los monocitos/macrófagos genera en estos un aumento de la capacidad fagocítica, tanto para S. aureus como para sus PGNs, y determinan también, el desarrollo de un perfil proinflamatorio en monocitos/macrófagos al inducirse en ellos un aumento de la proliferación, en la expresión de marcadores de activación CD14, CD80, CD86 y CD11, y en la secreción de las citoquinas TNF-?, IL-8, IL-12, IL-1? e IL-6 cuando se incuban con PGRPs en presencia o ausencia de PGNs. Además, observamos que las PGRPs disminuyen la acción de los PGNs en los procesos de apoptosis temprana y en el daño que estos causan sobre las membranas de estas células, al tiempo que aumentan su actividad metabolica. \nBasándonos en lo descrito podemos concluir que PGRP-S humana sería un dímero natural que es expresado en PMN como una proteína de 45 kDa, la cual es secretada al medio cuando el PMN degranula, y que su presencia puede ser detectada en suero. Por otro lado, los resultados obtenidos sugieren que las PGRPs serían reconocidas por moléculas presentes en la superficie celular de los monocitos favoreciendo la fagocitosis de bacterias como el S. aureus, y el daño en las membranas de las mismas. Por último, las PGRPs aumentarían la activación así como también la proliferación celular y la secreción de CKs proinflamatorias aumentando de esta manera, la respuesta inflamatoria, y por otra parte, estas tendrían un efecto protector sobre los monocitos/macrófagos, bloqueando la acción de los PGNs sobre los mismos

egc Superantigens Impair Monocytes/Macrophages Inducing Cell Death and Inefficient Activation

Bacterial superantigens (SAgs) are enterotoxins that bind to MHC-II and TCR molecules, activating as much as 20% of the T cell population and promoting a cytokine storm which enhances susceptibility to endotoxic shock, causing immunosuppression, and hindering the immune response against bacterial infection. Since monocytes/macrophages are one of the first cells SAgs find in infected host and considering the effect these cells have on directing the immune response, here, we investigated the effect of four non-classical SAgs of the staphylococcal egc operon, namely, SEG, SEI, SEO, and SEM on monocytic–macrophagic cells, in the absence of T cells. We also analyzed the molecular targets on APCs which could mediate SAg effects. We found that egc SAgs depleted the pool of innate immune effector cells and induced an inefficient activation of monocytic–macrophagic cells, driving the immune response to an impaired proinflammatory profile, which could be mediated directly or indirectly by interactions with MHC class II. In addition, performing surface plasmon resonance assays, we demonstrated that non-classical SAgs bind the gp130 molecule, which is also present in the monocytic cell surface, among other cells.Fil: Noli Truant, Sofia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: de Marzi, Mauricio Cesar. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina. Universidad Nacional de Luján; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Universidad Nacional de Luján. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable; ArgentinaFil: Sarratea, Maria Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Antonoglou, María Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Meo, Ana Patricia. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital General de Agudos "Ramos Mejía"; ArgentinaFil: Iannantuono López, Laura Valeria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Fernández Lynch, María Julieta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Todone, Marcos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Universidad Nacional de Luján. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable; ArgentinaFil: Malchiodi, Emilio Luis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Fernández, Marisa Mariel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentin

Evidence of size-dependent effect of silica micro- and nano-particles on basal and specialized monocyte functions

Aim: To analyze the effect of silica particles on monocyte/macrophage functions. Materials & methods: Silica micro- and nanoparticles were obtained by the Stober method. Their effect on monocyte/macrophage proliferation, activation, membrane integrity and metabolic activity were determined. Results: Silica particles inhibit cell proliferation while 10 nm nanoparticles (NPs) did not affect it. Similarly, silica particles induced strong cell activation. However, 10 nm NPs do not alter IL-12 or nitrite levels. Furthermore, bigger NPs and microparticles increase cell membrane damage and reduce the number of living cells but smallest NPs (10 and 240 nm) did not. Conclusion: Cell activation properties of silica particles could be useful tools for immune stimulation therapy, while 10 nm NPs would be suitable for molecule transportation.Fil: de Marzi, Mauricio Cesar. Universidad Nacional de Luján. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Saraceno, Martín. Universidad Nacional de Luján. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable; ArgentinaFil: Mitarotonda, Romina. Universidad Nacional de Luján. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable; ArgentinaFil: Todone, Marcos. Universidad Nacional de Luján. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Fernández, Marisa Mariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Malchiodi, Emilio Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; ArgentinaFil: Desimone, Martín Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco; Argentin

Peptidoglycan recognition protein–peptidoglycan complexes increase monocyte/macrophage activation and enhance the inflammatory response

Peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) are pattern recognition receptors (PRRs) that can bind or hydrolyze peptidoglycan (PGN). Humans have 4 PGRPs denominated PGRP-S, PGRP-L, PGRP-Iα and PGRP-Iβ. Mammalian PGRP-S has been implicated in intracellular destruction of bacteria by polymorphonuclear cells (PMN), PRGP-Iα and PGRP-Iβ have been found in keratinocytes and epithelial cells while PGRP-L is a serum protein that hydrolyzes PGNs. We expressed here recombinant human PGRPs and observed that PGRP-S and PGRP-Iα exist as monomer and disulfide dimer proteins. PGRPs dimers maintain their biological functions. We detected PGRP-S dimer in human serum and PMN, from where it is secreted after degranulation, being these cells a possible source of serum PGRP-S. Recombinant PGRPs do not act as bactericidal or bacteriostatic agents in the assayed conditions, however PGRP-S and PGRP-Iα cause slight damage in the bacterial membrane. Monocytes/macrophages increase S. aureus phagocytosis in the presence of PGRP-S, PGRP-Iα and PGRP-Iβ. All PGRPs bind to monocyte/macrophage membrane and are endocyted by them. In addition, all PGRPs protect cells from PGN-induced apoptosis. PGRPs increase THP-1 cell proliferation and enhance activation by PGN. PGRP-S-PGN complexes increase the membrane expression of CD14, CD80 and CD86, and enhance secretion of IL-8, IL-12and TNF-α, but reduce IL-10, clearly inducing an inflammatory profileFil: de Marzi, Mauricio Cesar. Consejo Nacional de Investigaciones Cientiâ­ficas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral "profesor R. A. Margni"; Argentina. Universidad Nacional de Lujan; Argentina. Universidad Nacional de Lujan. Instituto de Ecologia y Desarrollo Sustentable; ArgentinaFil: Todone, Marcos. Consejo Nacional de Investigaciones Cientiâ­ficas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral "profesor R. A. Margni"; Argentina. Universidad Nacional de Lujan; Argentina. Universidad Nacional de Lujan. Instituto de Ecologia y Desarrollo Sustentable; ArgentinaFil: Ganem, María Bernarda. Consejo Nacional de Investigaciones Cientiâ­ficas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral "profesor R. A. Margni"; ArgentinaFil: Wang, Qian. University Of Maryland. Biotechnology Institute; Estados UnidosFil: Mariuzza, Roy A.. University Of Maryland. Biotechnology Institute; Estados UnidosFil: Fernández, Marisa Mariel. Consejo Nacional de Investigaciones Cientiâ­ficas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral "profesor R. A. Margni"; ArgentinaFil: Malchiodi, Emilio Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Cientiâ­ficas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral "profesor R. A. Margni"; Argentin