Loss of the extraproteasomal ubiquitin receptor Rings lost impairs ring canal growth in Drosophila oogenesis

Rings lost fulfills a novel function in Drosophila development for a ubiquitin receptor as an essential mediator of ring canal growth during oogenesis

Molecular and functional analysis of the gene rings lost (CG4420) in the development of Drosophila melanogaster

Die Oogenese von Drosophila ist ein attraktives Modellsystem, um die Anordnung des Aktinzytoskeletts zu untersuchen. Zu Beginn der Oogenese wird eine 16-Zellzyste etabliert, in der alle Zellen durch Aktin-reiche zytoplasmatische Brücken, die sogenannten Ringkanäle, miteinander verbunden sind. Durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie konnten Proteine identifiziert werden, die zusammen mit F-Aktin am inneren Ring der Ringkanäle lokalisieren sowie Proteine, die näher an der Plasmamembran, dem äußeren Ring, positioniert sind. Zusammen regulieren diese Proteine die Stabilität und das Wachstum der Ringkanäle. Des Weiteren wurden subkortikale Aktinfilamente an der Plasmamembran der Keimbahnzellen beschrieben, sowie zytoplasmatische Aktinfilamente die ab Stadium 10 der Oogenese gebildet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein bisher nicht charakterisiertes Gen untersucht, dessen Protein einen Einfluss auf die Regulierung des Aktinzytoskeletts während der Oogenese von Drosophila hat. Keimbahnklone diese Gens zeigen einen Verlust von Ringkanälen in der Keimbahn, weshalb dem Gen der Name rings lost (rngo) verliehen wurde. Die zygotische Nullmutante von rngo ist pupal letal, was bedeutet, dass rngo essentiell für das Überleben der Fliege ist. Diese Letalität kann durch Transgene, die für GFP-Rngo-Fusionsproteine kodieren, gänzlich gerettet werden. Neben dem Verlust von Ringkanälen zeigen rngo-Keimbahnklone Defekte in der Größenkontrolle der Ringkanäle und eine Fehlverteilung von Ringkanal-assoziierten Proteinen. Des Weiteren ist eine Degenerierung der Plasmamembran von Keimbahnzellen und damit einhergehend das Einwandern von Nährzellkernen in die Oozyte sowie eine atypische Morphologie der Nährzellkerne und des Oozytenkerns zu beobachten. In rngo-mutanten Eikammern arretiert die Oogenese vor dem Stadium 9-10 jedoch ohne die Ausbildung von apoptotischen Merkmalen. Rngo weist durch seine Ubiquitin-ähnliche (UBQ)- und Ubiquitin-assoziierte (UBA)-Domäne die typische Struktur eines extraproteasomalen Polyubiquitinrezeptors auf. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Rngo genau wie andere extraproteasomale Polyubiquitinrezeptoren an das Proteasom sowie, vermittelt durch seine UBA-Domäne, an Ubiquitin bindet. Außerdem konnte durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie gezeigt werden, dass Rngo mit Ubiquitin und dem Proteasom in Ovarien kolokalisiert. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass Rngo an der proteasomalen Degradierung von Proteinen beteiligt ist, die für die Aufrechterhaltung des Aktinzytoskeletts notwendig sind. Unter den extraproteasomalen Polyubiquitinrezeptoren nimmt Rngo eine Sonderrolle ein, da die UBQ- und UBA-Domäne eine retrovirale Aspartatprotease-Domäne (RVP) flankieren. Durch die Homodimerisierung von Proteinen, die eine solche RVP-Domäne aufweisen, wird das katalytische Zentrum von z wei Aspartaten gebildet. Bisher wurde jedoch für die humanen Homologe (HDdi1/HDdi2) und das Homolog in der Hefe (Ddi1/Vsm1) keine proteolytische Aktivität dieser RVP-Domäne beschrieben. Wie schon für Ddi1/Vsm1 gezeigt, bildet auch Rngo, vermittelt durch die RVP-Domäne, Dimere. Das potentielle katalytische Aspartat257 wird hierfür nicht benötigt. In der vorliegenden Arbeit lassen jedoch Überexpressionsversuche von GFP-Fusionsproteinen, in denen das katalytische Aspartat257 gegen ein Alanin ausgetauscht wurde, auf eine solche proteolytische Funktion der RVP-Domäne von Rngo schließen. Es ist zu vermuten, dass dominant-negative Effekte einer Überexpression dieses GFP-D257A-Fusionsproteins, ähnlich der rngo-Keimbahnklone, zu einer Degenerierung der Plasmamembran in den Keimbahnzellen führen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein bisher nicht charakterisiertes Protein beschrieben, welches für die Etablierung und Anordnung des Aktinzytoskeletts verantwortlich ist. Weiterhin konnte Rngo als erstem Protein der Ddi1-Familie eine katalytische Aktivität der RVP-Domäne zugeordnet werden.Oogenesis of Drosophila is an attractive model system to study the arrangement of the actin-cytoskeleton. At the beginning of oogenesis a 16-cell cyst is formed and all cells of these cyst are interconnected via actin-rich cytoplasmic bridges, the so-called ring canals. By immunofluorescence microscopy proteins could be identified that localize with F-actin at the inner ring of the ring canals as well as proteins that are positioned closer to the plasma membrane, the outer ring. Together, these proteins regulate the stability and growth of the ring canals. Also subcortical actin filaments at the plasma membrane of the germ line cells and cytoplasmic actin filaments that are formed from stage 10 of oogenesis were described within oogenesis. In this work, a previously uncharacterized gene was studied and the protein coded by this gene has an influence on the regulation of the actin-cytoskeleton during oogenesis of Drosophila. Germ line clones of this gene show a loss of ring canals in the germ line and therefore we named it rings lost (rngo). The zygotic null mutant of rngo is lethal in pupal stages, which means that rngo is essential for the survival of the fly. This lethality can be rescued completely by transgenes encoding GFP-fusion proteins of Rngo. Besides the loss of ring canals rngo germ line clones show defects in the growth control of the ring canals and a mislocalization of ring canal-associated proteins. We could also observe a degeneration of the plasma membrane of germ line cells and as a consequence of this a migration of nurse cell nuclei into the former oocyte. We could also quite frequently observe an atypical morphology of nurse cell nuclei and the oocyte nucleus. In rngo-mutant egg chambers oogenesis arrests before stage 9-10, but without showing apoptosis. Rngo shows, through its ubiquitin-like (UBQ)- and ubiquitin-associated- (UBA) domain, the typical structure of an extraproteasomal polyubiquitinreceptor. In this study we showed that Rngo, like other extraproteasomal polyubiquitinreceptor, can bind to the proteasome and, mediated through its UBA-domain bind to ubiquitin. Moreover, it was shown by immunofluorescence microscopy that Rngo colocalizes with ubiquitin and the proteasome in ovaries. These results suggest that Rngo is involved in the proteasomal degradation of proteins that are necessary for the maintenance of the actin-cytoskeleton. Among the extraproteasomal polyubiquitinreceptors Rngo takes a special role because the UBQ-UBA-domains are flanking a retroviral aspartate protease domain (RVP). Due to the homodimerization of proteins that have such an RVP-domain, the catalytic center is formed by two aspartates. So far no proteolytic activity of these RVP-domains was described for the human homologues (HDdi1/HDdi2) and the yeast homologue (Ddi1/Vsm1) of Rngo. As already shown for Ddi1/Vsm1, Rngo also forms homodimers mediated by the RVP-domain. The potential catalytic Aspartat257 is not required. However, in the present study overexpression of GFP fusion proteins in which the catalytic Aspartat257 was replaced with an alanine show dominant negative effects, which point to a proteolytic function of the RVP-domain of Rngo. It is likely that dominant-negative effects of overexpression of the D257A-GFP fusion protein, similar to the rngo-germ line clones, lead to a degeneration of the plasma membrane in the germ line cells. In the present study a previously uncharacterized protein was described, which is responsible for the maintenance and arrangement of the actin-cytoskeleton. Furthermore, it was Rngo as the first protein of Ddi1 family for which a catalytic activity of RVP-domain was assigned

Protein Homeostasis, Aging and Alzheimer’s Disease

Alzheimer’s disease (AD) is one key medical challenge of the aging society and despite a great amount of effort and a huge collection of acquired data on molecular mechanisms that are associated with the onset and progression of this devastating disorder, no causal therapy is in sight. The two main hypotheses of AD, the amyloid cascade hypothesis and the Tau hypothesis, are still in the focus of AD research. With aging as the accepted main risk factor of the most important non familial and late onset sporadic forms of AD, it is now mandatory to discuss more intensively aspects of cellular aging and aging biochemistry and its impact on neurodegeneration. Since aging is accompanied by changes in cellular protein homeostasis and an increasing demand for protein degradation, aspects of protein folding, misfolding, refolding and, importantly, protein degradation need to be linked to AD pathogenesis. This is the purpose of this short review