Gata2 and Gata3 regulate the differentiation of serotonergic and glutamatergic neuron subtypes of the dorsal raphe

Peer reviewe

Molecular Fingerprint and Developmental Regulation of the Tegmental GABAergic and Glutamatergic Neurons Derived from the Anterior Hindbrain

Tegmental nuclei in the ventral midbrain and anterior hindbrain control motivated behavior, mood, memory, and movement. These nuclei contain inhibitory GABAergic and excitatory glutamatergic neurons, whose molecular diversity and development remain largely unraveled. Many tegmental neurons originate in the embryonic ventral rhombomere 1 (r1), where GABAergic fate is regulated by the transcription factor (TF) Tal1. We used single-cell mRNA sequencing of the mouse ventral r1 to characterize the Tal1-dependent and independent neuronal precursors. We describe gene expression dynamics during bifurcation of the GABAergic and glutamatergic lineages and show how active Notch signaling promotes GABAergic fate selection in postmitotic precursors. We identify GABAergic precursor subtypes that give rise to distinct tegmental nuclei and demonstrate that Sox14 and Zfpm2, two TFs downstream of Tal1, are necessary for the differentiation of specific tegmental GABAergic neurons. Our results provide a framework for understanding the development of cellular diversity in the tegmental nuclei.Peer reviewe

GATA transcription factors and their co-regulators guide the development of GABAergic and serotonergic neurons in the anterior brainstem

The anterior hindbrain segment rhombomere 1 (r1) generates in its ventral (basal) region GABAergic and serotonergic neurons that give rise to various nuclei in the adult brainstem that participate in the modulation of mood and motivation. This thesis focuses on the function of specific transcription factors (TFs) and their co-regulators that control the differentiation of r1derived neurons and their subtypes. First, we characterized early ventral r1 development to determine which neurons are generated in this area. In general, the developing neural tube can be divided dorso-ventrally into multiple progenitor domains that have distinct gene expression patterns and give rise to diverse cell types. We found that ventral r1 contains at least three different progenitor domains. Using genetic fate mapping in the mouse, we determined that the two most ventral progenitor domains (Nkx2-2+ rp3 and rpvMN) produce serotonergic neurons and oligodendrocytes, whereas the more dorsal progenitor domain (Nkx6-1+ rp2) generates GABAergic and glutamatergic neurons. By combining single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and expression analyses of subtype-specific TFs, we show that embryonic ventral r1 contains molecularly distinct populations of post-mitotic GABAergic and glutamatergic precursors. We further report that GABAergic neurons from ventral r1 give rise to multiple GABAergic nuclei in the anterior brainstem, such as the posterior substantia nigra pars reticulata (pSNpr), rostromedial tegmental nucleus (RMTg) and ventral tegmental nucleus (VTg), whereas GABAergic neurons of the dorsal tegmental nucleus (DTg) originate from progenitors located in dorsal region of r1. Second, we analysed the functions of GATA TFs and their regulators in the development of r1derived GABAergic neurons by conditional mouse mutagenesis. We showed that GATA2 and GATA3, together with their co-factor TAL1, act as neuron-type selectors in early post-mitotic precursors to promote a GABAergic over glutamatergic neuron fate. Analysis of these mutants during later developmental stages showed that GABAergic neurons in the pSNpr, RMTg and VTg were absent, while the number of glutamatergic neurons was increased in other nuclei such as the interpeduncular nucleus (IPN) and the laterodorsal tegmental nucleus (LDTg). We found that ZFPM1 and ZFPM2, two GATA cofactors, are also expressed in GABAergic neuron precursors in r1. However, ZFPM2 does not function as a neuron-type selector in these cells, but rather is required for the proper development of pSNpr, RMTg and VTg GABAergic neurons. Finally, we studied the role of GATA2, GATA3 and ZFPM1 in the development of dorsal raphe (DR) serotonergic neurons in r1. Conducting overexpression experiments in chicken embryos, we demonstrated that GATA2 and GATA3 guide the differentiation of serotonergic neurons in the absence of their TAL1 partner, which is vital for GABAergic differentiation. We determined that GATA2 acts as a neuron-type selector and is important for all post-mitotic serotonergic neuron precursors to acquire serotonergic identity, whereas GATA3 is required for the differentiation of specific subtype of serotonergic neurons from r1. In addition, GATA2 and GATA3 are necessary for the development of non-serotonergic glutamatergic neurons in the DR. It was further shown that the GATA cofactor ZFPM1 is essential for the correct development of serotonergic neurons in DR subregions DRVL (ventrolateral part of dorsal raphe) and DRD (dorsal part of dorsal raphe). Loss of ZFPM1 function resulted in increased anxiety-like behaviour and elevated contextual fear memory, a phenotype that was alleviated by chronic treatment with fluoxetine, a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI). In conclusion, this work reveals neuronal subtypes present in and mechanisms involved with anterior brainstem development and that are important in the determination of behavioural phenotypes. Furthermore, it demonstrates that a complex gene regulatory system, where functions of GATA family selector TFs are modulated by their cofactors, is employed to achieve cell diversity in the central nervous system, mechanisms of which share marked similarities with cell fate determination programs in other developing tissues, such as the hematopoietic system.Alkion taka-aivojen etummainen osa, rhombomeeri 1 (r1), tuottaa aivorungon tumakkeiden GABAergisia, glutamatergisia ja serotonergisia hermosoluja, jotka osallistuvat mm. mielialan ja motivaatiokäyttäytymisen säätelyyn. Tämä väitoskirja käsittelee transkriptiotekijöitä (engl. transcription factors, TF) ja niiden liittyviä säätelyproteiineja, jotka ohjaavat hermosolutyyppien kirjon kehittymistä vatsanpuoleisessa (ventraalisessa) r1:ssa. Kuvasimme ensin millaisia hermosoluja alkion ventraalisesta r1:stä syntyy. Kehittyvä hermostoputki jakautuu selkä-vatsa akselilla useisiin jakautuvien hermokantasolujen alueisiin, joista syntyy kullekkin alueelle tyypillisiä hermosoluja. Havaitsimme hiirialkion ventraalisessa r1:ssa ainakin kolme hermokantasolualuetta. Geneettisellä solulinjastojen seurannalla osoitimme, että ventraalisimmat kantasolualueet (Nkx2-2 ilmentävät rp3 ja rpvMN) tuottavat serotonergisia hermosoluja ja oligodendrosyytti- hermotukisoluja, kun taas niiden selänpuoleinen alue (Nkx6-1 ilmentävä rp2) tuottaa GABAergisia ja glutamatergisia hermosoluja. Yksittäisten solujen mRNA sekvenoinnilla (engl. single cell mRNA sequencing, scRNAseq) ja TF:n ilmenemisanalyyseillä osoitimme, että alkion ventraalinen r1 sisältää kirjon erilaisia solusyklistä poistuneita ja hermosoluerilaistumisen aloittaneita GABAergisten ja glutamatergisten hermosolujen esiastesoluja. Tämän lisäksi kuvasimme miten ventraaliset GABAergiset esiastesolut osallistuvat aivorungon tumakkeiden, kuten posteriorisen substantia nigra pars reticulatan (pSNpr), rostromediaalisen tegmentaalisen tumakkeen (RMTg) ja ventraalisen tegmentaalisen tumakkeen (VTg), kehitykseen. Toisaalta osoitimme VTg:n vieressä sijaitsevan dorsaalisen tegmentaalisen tumakkeen (DTg) GABAergisten solujen olevan peräisin toisesta selänpuolisemmasta esiastesolujen joukosta. Seuraavaksi tutkimme GATA perheen TF:n ja niihin liittyvien säätelyproteiinien tehtäviä ventraalisen r1:n GABAergisten hermosolujen kehityksessä. Käyttäen kudoskohdennettua mutageneesiä hiirialkiossa osoitimme, että GATA2 ja GATA3 sekä niihin liittyvä TF TAL1 ohjaavat solusyklistä poistuneiden hermosolujen esiastesolujen erilaistumista GABAergisiksi hermosoluiksi ja estävät niitä erilaistumasta glutamatergisiksi hermosoluiksi. Tämän seurauksena hiiriltä, joilla nämä TF geenit on mutageneesillä tuhottu, puuttuvat pSNpr:n, RMTg:n, ja VTg:n GABAergiset hermosolut, kun taas glutamatergisten hermosolujen määrä interpedunkulaarisessa tumakkeessa (IPN) ja laterodorsaalisessa tumakkeessa (LDTg) on lisääntynyt. Havaitsimme myös, että GATA TF:n liittyvät säätelyproteiinit ZFPM1 ja ZFPM2 ilmenevät ventraalisen r1:n GABAergisten hermosolujen esiastesoluissa. Osoitimme, että ZFPM2 ei ole välttämätön esiastesolun GABAergisen hermosoluidentiteetin valinnalle, mutta se ohjaa pSNpr:n, RMTg:n ja VTg:n tumakkeiden myöhempää kehitystä. Lopuksi tutkimme GATA2, GATA3 ja ZFPM1 TF:n tehtäviä r1:ssä sijaitsevan dorsaalisen raphe (DR) tumakkeen serotonergisten hermosolujen kehityksessä. Kana-alkioilla tehdyllä kokeilla osoitimme, että GATA2 ja GATA3 ohjaavat serotonergisten hermosolujen erilaistumista ilman TAL1 TF kumppania, toisin kuin GABAergisissa soluissa, joissa GATA2, GATA3 ja TAL1 toimivat yhteistyössä. Osoitimme, että GATA2 on serotonergisen hermosoluidentiteetin selektorigeeni, joka vaaditaan kaikkien serotonergisten hermosolujen esiastesolujen erilaistumiseen. GATA3 puolestaan vaaditaan osassa kehittyviä serotonergisia hermosoluja ja GATA2 ja GATA3 yhdessä ohjaavat DR tumakkeen keskellä sijaitsevien ei-serotonergisten hermosolujen kehitystä. GATA TF:n säätelytekijä ZFPM1 on tärkeä DR:n ventrolateraalisen (DRVL) serotonergisten hermosolujen kehitykselle. Osoitimme että hiiret, joiden ZFPM1 geeni on inaktivoitu, ovat ahdistuneempia ja niillä on kohonnut pelkoehdollistumisen taso, joka on normalisoitavissa selektiivisellä serotoniinin takaisinoton estäjällä (SSRI fluoxetine). Yhteenvetona tämä työ kuvaa aivorungon etuosan hermosolujen alaryhmiä, niiden molekylaarisia erityispiirteitä, kehityksellisiä mekanismeja ja merkitystä käyttäytymiselle. Työ osoittaa, että samoin kuin eräissä muissa kehittyvissä kudoksissa, kuten hematopoieettisissa soluissa, GATA tekijöiden ja niihin liittyvien TF:n ohjaama geenisäätelyverkosto ohjaa aivorungon solujen kirjon kehitystä

Inactivation of the GATA Cofactor ZFPM1 Results in Abnormal Development of Dorsal Raphe Serotonergic Neuron Subtypes and Increased Anxiety-Like Behavior

Serotonergic neurons in the dorsal raphe (DR) nucleus are associated with several psychiatric disorders including depression and anxiety disorders, which often have a neurodevelopmental component. During embryonic development, GATA transcription factors GATA2 and GATA3 operate as serotonergic neuron fate selectors and regulate the differentiation of serotonergic neuron subtypes of DR. Here, we analyzed the requirement of GATA cofactor ZFPM1 in the development of serotonergic neurons using Zfpm1 conditional mouse mutants. Our results demonstrated that, unlike the GATA factors, ZFPM1 is not essential for the early differentiation of serotonergic precursors in the embryonic rhombomere 1. In contrast, in perinatal and adult male and female Zfpm1 mutants, a lateral subpopulation of DR neurons (ventrolateral part of the DR) was lost, whereas the number of serotonergic neurons in a medial subpopulation (dorsal region of the medial DR) had increased. Additionally, adult male and female Zfpm1 mutants had reduced serotonin concentration in rostral brain areas and displayed increased anxiety-like behavior. Interestingly, female Zfpm1 mutant mice showed elevated contextual fear memory that was abolished with chronic fluoxetine treatment. Altogether, these results demonstrate the importance of ZFPM1 for the development of DR serotonergic neuron subtypes involved in mood regulation. It also suggests that the neuronal fate selector function of GATAs is modulated by their cofactors to refine the differentiation of neuronal subtypes.Peer reviewe