USE OF COMBINATION OF FLUORESCENT PROBES TO IDENTIFY SPERM SUBPOPULATIONS FOR QUALITY ASSESSMENT OF FRESH AND CRYOPRESERVED CANINE SEMEN. PRELIMINARY RESULTS

The use of fluorescent markers in the evaluation of sperm morphophysiology allows a better accuracy, compared to the subjective nature of some routine tests in semen qualification. In this study was used the combination of fluorescence probes: propionate iodide, Hoechst 33342 and FITC-PSA in fresh and thawed dog semen, to the identification of the following morphological subpopulations: II (intact plasma and acrosomal membranes), IL (intact plasma membrane and lesioned acrosomal membrane), LI (lesioned plasma membrane and intact acrosomal membrane) and LL (both membranes lesioned). When comparing the results obtained with the results of the tests used conventionally in semen evaluation (sperm motility and vigor, hypoosmotic test and morphological alterations), little correlation was observed. The II population declined from fresh semen to thawed, while LL population increased (p <0.05). The IL population was composed of extremely small numbers of cells but increased (p <0.05) from fresh semen to thawed semen. In the thawed semen the major defects had a positive correlation with the LL population (p <0.01). For the thawed semen, the results of the hypoosmotic test (number of cells that reacted to the medium) correlated positively with population II (p <0.025), that is, different from that observed in fresh semen. Although all tests were able to detect decrease in sperm quality post-thawing (p <0.05). The use of this fluorescent probe association allowed qualification and more accurately quantification of plasma membrane and acrosomal insults mediated by cryopreservation. El uso de marcadores fluorescentes en la evaluación de la morfofisiología espermática permite una mayor precisión, comparada con la naturaleza subjetiva de algunas pruebas de rutina en la valoración del semen. En este estudio se usó la combinación de pruebas fluorescentes: yoduro de propidio; Hoechst 33342 y FITC-PSA en semen fresco y descongelado de perro, para la identificación de las siguientes subpoblaciones morfológicas: II (membranas plasmática y acrosomal intactas), IL (membrana plasmática intacta y membrana acrosomal dañada), LI (membrana plasmática dañada y membrana acrosomal intacta) y LL (ambas membranas dañadas). Cuando se comparan los resultados obtenidos con los resultados de las pruebas usadas convencionalmente en la evaluación seminal (motilidad y vigor espermáticos, prueba hipoosmótica y alteraciones morfológicas), se observó poca correlación. La población II disminuyó desde el semen fresco al descongelado, mientras que la población LL se incrementó (p<0.05). la población IL estuvo compuesta por un número extremadamente pequeño de células, pero incremento (p<0.05) desde el semen fresco al descongelado. En el semen descongelado los defectos mayores tuvieron una correlación positiva con la población LL (p<0.01). En el semen descongelado, los resultados de la prueba hipoosmótica (número de células que reaccionan al medio) se correlacionaron positivamente con la población II (p<0.05). El uso de esta asociación de pruebas fluorescentes permitió la valoración y la cuantificación más precisa de los daños a la membrana plasmática y acrosomal mediados por la criopreservación.

Effects of a calcium quelant agent in the quality of frozen-thawed dog sperm

Objetivou-se por meio deste trabalho avaliar o efeito da redução da quantidade de cálcio livre no meio de congelamento, utilizando o quelante de cálcio EDTA nas concentrações de 0,3% e 0,5%, sobre a qualidade do sêmen descongelado de cães. O ejaculado de três cães sem raça definida foi coletado por manipulação peniana e avaliado quanto ao vigor, motilidade espermática, morfologia espermática e pelo teste hiposmótico (HOST). Posteriormente, o sêmen foi separado em três alíquotas, as quais foram diluídas respectivamente no meio controle (TGE), de forma a se obter uma concentração final de 50 x 106 espermatozoides móveis/mL, 6% de glicerol e 0,5% de Equex STM Paste® em meio Tris-Citrato com gema de ovo (20% V/V); no meio de congelamento EDTA 0,3, com a mesma constituição do TGE, porém acrescido de EDTA para uma concentração final de 0,3%; e no meio de congelamento EDTA 0,5 em que o EDTA foi acrescido para uma concentração final de 0,5%. Após envasado em palhetas de 0,25mL o sêmen de cada tratamento foi resfriado por duas horas e congeladas em vapor de nitrogênio por 15 minutos. As amostras foram descongeladas por imersão em água a 37oC, durante sete segundos e avaliadas da mesma forma que o sêmen fresco e pelos testes de termorresistência, de ligação à membrana perivitelina de ovo de galinha (MPOG) e quanto à integridade das membranas plasmática e do acrossoma por coloração com sondas fluorescentes. A concentração do cálcio foi dosada, em espectrofotômetro, no sêmen fresco diluído no meio TGE e depois de descongelado. Houve redução (Duncan a 5% de significância; p0,05) em relação ao grupo TGE, com 10,8% a 14% de espermatozoides apresentando ambas as membranas íntegras. No teste hiposmótico, não houve diferença (p>0,05) na quantidade de espermatozoides com integridade funcional da membrana nos tratamentos EDTA 0,3 e EDTA 0,5 em relação ao grupo TGE. Não houve diferença na quantidade de espermatozoides aderidos à MPOG e na longevidade espermática (TTR) entre o grupo TGE e os tratamentos EDTA 0,3 e EDTA 0,5. Não houve diferença (p>0,05) na motilidade espermática entre o grupo TGE (74,70%) e o tratamento EDTA 0,3 (62,78%) porém, houve redução (p 0.05) compared to group TGE, with 10.8 % to 14% of sperm showing both membranes intact. There was also no difference in the number of spermatozoa bound to MOPG in the group TGE and EDTA0.3 and EDTA0.5 treatments. Although there was no difference (p> 0.05) in sperm motility between the TGE group (74.70%) and EDTA0.3 (62.78%) treated group, this parameter decreased (p <0.05) in EDTA0.5 treatment (45%), emphasizing the importance of calcium for sperm motility. Therefore the reduction or elimination of free calcium in the freezing medium able to reduce the premature cryocapacitaion and acrosome reaction, which would improve sperm quality after thawing. Thus there are other factors in the medium and / or processing used that are triggering injury and favoring the incidence of premature capacitation and AR in sperm.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerai

Andrologic evaluation and cryopreservation of adult cougar s (Puma concolor Linnaeus, 1771) semen

Os felinos silvestres estão entre as espécies mais ameaçadas do mundo, e sua população é afetada por fatores que variam geograficamente, seja a descaracterização de habitats, disponibilidade de alimentos, forte pressão de caça ou baixa densidade populacional. Tecnologias de reprodução assistida, como a criopreservação de gametas e a fertilização in vitro, são ferramentas fundamentais para a conservação das espécies, uma vez que auxiliam na manutenção de uma população geneticamente viável e permitem translocação de material genético sem a necessidade do transporte dos animais. O presente estudo objetivou coletar sêmen de pumas (Puma concolor) assim como descrever as características físicas e morfológicas do sêmen e também avaliar a congelabilidade do sêmen desta espécie empregando dois meios de congelamento a base de TRIS-citrato e gema de ovo, sendo um com 5% de glicerol e outro com 7,5%. Foram utilizados cinco pumas adultos mantidos em condições de cativeiro no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do estado do Mato Grosso do Sul Brasil (CRAS-MS). Os animais foram anestesiados com associação de cloridrato de quetamina e cloridrato de xilazina nas doses de 10 mg/kg e 1,2 mg/kg, respectivamente. |Posteriormente foi realizada a coleta, por meio da eletroejaculação, que consistiu na aplicação de um máximo de 4 séries de 10 estímulos elétricos de 16V. Após a sedação, procedeu-se a coleta de urina e lavagem da bexiga com solução fisiológica estéril. O sêmen coletado foi analisado quanto ao aspecto físico (cor e odor), volume, concentração e morfologia espermática, além do vigor e da motilidade, que foram utilizados para o cálculo do índice espermático. O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 mL, resfriado sob uma taxa de 0,55ºC/min por duas horas (uma hora de resfriamento e mais uma hora de equilíbrio) e por fim congelado a uma taxa de 5,8ºC/min. As amostras de sêmen foram descongeladas em banho maria a 37ºC por 30 segundos e avaliadas quanto ao vigor e à motilidade espermática, além dos teste de termorresistência e hiposmótico. O protocolo proposto para coleta de sêmen de puma mantidos em cativeiro mostrou-se eficiente, com a obtenção de amostras livres de contaminação com urina e com uma média total de espermatozóides por ejaculado superior à descrita na literatura para esta espécie. O índice espermático observado nas amostras frescas também foi superior ao descrito na literatura. A média de patologias totais observada foi de 53,88% e apesar da elevada taxa de espermatozóides patológicos, apenas um indivíduo dentre os pumas avaliados mostrou-se teratospérmico. As patologias mais frequentemente observadas foram cauda fortemente dobrada ou enrolada, cauda dobrada ou enrolada e cauda enrolada na cabeça. O protocolo de congelamento e descongelamento empregado mostrou-se satisfatório na criopreservação de sêmen de puma. O índice espermático declinou somente após 40 minutos de incubação a 38ºC em ambos os meios testados (16,25% no meio com 5% de glicerol e 11,25% no meio com 7,5%) e em média de 25 a 29% dos espermatozóides apresentaram integridade na membrana plasmática. Não foram observadas diferenças (p>0,05) entre os parâmetros avaliados após a criopreservação, utilizando as diferentes concentrações de glicerol no meio TRIS- gema de ovo.The wild felines is one of the most endangered species of the world and its population is affected by some factors that vary geographically because of the alduteration of their habitat, food available, strong hunt pressure or even the low population density. Assisted reproduction techniques such as gamete s cryopreservation and in vitro fertilization are fundamental for the conservation as they contributes to restoring genetic vigor and makes possible to transfer genetics sources without moving the animals itself. The aim of this study is collect semen from cougar (Puma concolor), describe its physics and morphologics characteristics and also evaluate its frozen capacity using two extenders with TRIS- citrate and egg yolk were evaluated, one with 5% of glycerol and the other with 7.5%. Five captive adult cougars from Mato Grosso do Sul s Rehabilitation Center Brazil (CRAS-MS) were used. The anesthetic protocol was an association of ketamine (10 mg/kg) and xilazine (1.2 mg/kg). Semen collection was done through electroejaculation method with a maximum of four series of 10 stimuli with 16 Volts. Before with collection the urine was collected and the bladder was washed with sterile physiologic solution. The semen samples were evaluated using the following parameters: physics aspects (color and smell), volume, concentration, morphology, sperm progressive status, sperm motility. The last two parameters were used to calculate the sperm motility index. The semen samples were packed in 0.25 ml straws, cooled at a rate 0.55ºC/min during two hours (one for de cooling and one in equilibrium) and finely frozen at a rate 5.8ºC/min. The thawing was carried through immersion in water at 37ºC during 30 seconds. The post thawed samples were evaluated using the sperm progressive status, sperm motility, sperm longevity (thermorresistance test) and hiposmotic swelling tests. The protocol used in this study for captive cougar s semen collection were efficient, with the acquisition of samples free from urine and a medium of total spermatozoids per ejaculate higher than those describe in literature for this species. The sperm motility index was also higher than those describe in literature. The medium of structurally abnormal spermatozoa were 53.88% and besides the high pleiomorphic rate only one animal between those evaluated at this study was considered teratospermic. The most frequent pathologies were tightly coiled or bent tail, coiled or bent tail and tail coiled on the head. The cryopreservation and thawing protocol were good for the cryopreservation of cougar s semen. The sperm motility index reduced only after 40 minutes of incubation at 38ºC for both extenders tested (16.25% in the extender with 5% of glycerol and 11.25% in the extender with 7.5%) and a medium of 25 to 29% of the spermatozoids showed plasmatic membrane integrity. There was no difference (p>0.05) between the two concentrations of glycerol used, according to the parameters evaluated

In situ and ex situ jaguar (Panthera onca) reproduction: What do we have so far?

Assisted reproductive technologies enable the transportation and exchange of genetic material, so it is an essential complementary tool in conservation programs. Unfortunately, the difficulty of accessing a significant number of animals under suitable physiological conditions hampers the advancement of these technologies. Pharmacological semen collection in jaguars is effective in acquiring a sufficient amount of sperm. However, the outcomes of artificial insemination (AI) and in vitro fertilization operations are impacted by poor sperm quality and limited freezability of the cells. Hormonal stimulation with eCG and hCG may be used to collect oocytes in jaguars; however, proximity to males influences ovarian response to exogenous hormones. Thus, the non-copulatory ovulation stimuli pattern must be considered in AI and laparoscopic ovum pick-up protocols in this species. Somatic cells may be an alternative for biobanks since they are easier to collect and transport and can be obtained from any age, sex, or origin of an animal, including post-mortem samples. Our research group recently succeeded in cultivating cells from three jaguars that were found dead on highways, demonstrating that cultivation is effective even in degenerating tissues. In this instance, xenotransplantation of cryopreserved fragments improved culture effectiveness and brought cell quality back up to par with that of fresh tissue

Efficient recovery of in vivo mature and immature oocytes from jaguars (Panthera onca) and pumas (Puma concolor) by Laparoscopic Ovum Pick-Up (LOPU)

The jaguar and the puma play an essential role in balancing the ecosystem. Developing reproductive biotechnologies for such species could permit the exchange of genetic material across in situ and ex situ populations, encompassing the concept of One Conservation. Therefore, the purpose of the current study was to compare different gonadotropin stimulation strategies in conjunction with laparoscopic ovum pick-up (LOPU) technology for the recovery of immature and mature oocytes from these species. Adult female pumas (n = 10) and jaguars (n = 11) underwent 12 and 16 LOPU treatments, respectively. Hormonal stimulation was performed with eCG (750 IU for pumas; 800 IU for jaguars; im), and they were randomized into two treatment groups: Group 1 (G1) received hCG (500 IU, im) approximately 85 h after eCG administration to promote oocyte maturation and recover in vivo matured oocytes; and Group 2 (G2) did not receive hCG to recover immature oocytes. Between the two treatments, a total of 416 and 160 viable oocytes were recovered, 205 and 80 from G1 and 211 and 80 from G2-treated females from pumas and jaguars, respectively. We found that LOPU is a safe technique for getting high-quality oocytes from wild cats, such as pumas and jaguars, and that it may be included in conservation efforts. In pumas and jaguars, protocols employing eCG for ovarian stimulation are effective, as is the use of hCG to stimulate in vivo oocyte maturation prior to collection

Criptorquidismo em jaguatirica de vida livre capturada no Parque Estadual do Rio Doce, Brasil

O presente trabalho consiste no primeiro relato de criptorquidismo em uma jaguatirica, adulta, de vida livre. Para a captura foram empregadas armadilhas com desarme de guilhotina, usando como isca vísceras de bovino. O animal foi contido quimicamente por meio de dardos anestésicos e mantido sob anestesia, utilizando a associação de cloridrato de quetamina e cloridrato de xilazina. Durante o exame andrológico, observou-se que o testículo esquerdo localizava-se subcutâneo, próximo à região inguinal, caracterizando-se criptorquidismo unilateral. Esse testículo apresentava-se flácido, com volume de 2,57mL, enquanto o testículo contralateral apresentava consistência firme e volume de 11,50mL. A área ocupada pelas espículas penianas mostrou-se compatível com a de animais reprodutores. O criptorquidismo é uma condição hereditária ligada à baixa variabilidade genética, já relatada em felinos silvestres consanguíneos. Nesse sentido, devido ao crescente isolamento populacional em fragmentos florestais, este achado torna-se preocupante, uma vez que pode ser indicativo de endogamia em populações de jaguatiricas de vida livre.This paper is the first report of unilateral cryptorchidism in an adult wildlife ocelot, captured in Parque Estadual do Rio Doce. Cage traps were used to capture the animal, using bovine offal as bait. The animal was anesthetized with anesthetic darts and kept under anesthesia through a combination of ketamine and xylazine. The andrologycal examination showed that the left testicle was located subcutaneously near the inguinal region. In this case of unilateral cryptorchidism, the testis was soft and had a volume of 2.57mL, while the contralateral testis had a firm consistency and volume of 11.50mL. The length of the region occupied by the penile spikes was similar to other breeding animals. Cryptorchidism is an inherited condition linked to low genetic variability previously reported in consanguineous wild cats. Due to the increasing isolation of wild population in forest fragments, this finding is concerning because it can be indicative of inbreeding in wild ocelot populations

Comparação entre duas concentrações de glicerol para a criopreservação de sêmen de suçuarana (Puma concolor) Comparison between two glycerol concentrations to cryopreservation of semen of mountain lions (Puma concolor)

O desenvolvimento de biotécnicas de reprodução é uma importante ferramenta para a conservação de animais silvestres ameaçados de extinção. Procedimentos de reprodução assistida em suçuarana, no entanto, são escassos na literatura, em especial aqueles relacionados à criopreservação de sêmen. Neste sentido, o presente trabalho objetivou avaliar a congelabilidade do sêmen de suçuaranas adultas mantidas em cativeiro, por meio da comparação entre duas concentrações de glicerol no meio de congelamento. Foram usados cinco machos adultos de suçuarana, mantidos no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do Mato Grosso do Sul (CRAS/MS). As amostras foram coletadas por eletroejaculação e avaliadas quanto ao seu aspecto físico, volume, vigor, motilidade, concentração e índice espermático. De cada ejaculado duas alíquotas foram diluídas em meio Tris-citrato-gema de ovo, em concentrações finais de 5 e 7,5% de glicerol, resfriadas a uma taxa de -0,55ºC/min e congeladas a uma taxa de -5,8ºC/min. Depois de descongeladas, as amostras foram reavaliadas e submetidas aos testes de termorresistência e hiposmótico. O protocolo de criopreservação e descongelamento de sêmen proposto se mostrou eficiente em ambas as concentrações de glicerol testadas, não havendo diferença (p>0,05) entre estas.<br>The development of biotechnologies of reproduction is an important tool for the conservation of wild animals threatened with extinction. Assisted reproduction procedures in mountain lions, however, are scarce, especially those related to sperm cryopreservation. In this context, this study aimed to evaluate the freezing capacity of semen from adult mountain lions in captivity through the comparison of two concentrations of glycerol in the freezing media. Five adult male mountain lions were used, held at the Rehabilitation Center for Wild Animals of Mato Grosso do Sul (CRAS/MS). Samples were collected by electroejaculation and evaluated for physical appearance, volume, sperm progressive status, sperm motility, sperm concentration and sperm motility index. Each ejaculate was spliced into two aliquots and diluted in Tris-citrate-half egg yolk, at final concentrations of 5 and 7.5% glycerol, cooled at a rate of -0.55ºC/min and frozen at a rate of -5.8ºC/min. Once thawed, the samples were re-evaluated and tested for thermoresistance and hypoosmotic swelling. The suggested protocol for cryopreservation and thawing of semen is efficient in both glycerol concentrations tested, with no difference (p>0.05) between them

Comparação entre duas concentrações de glicerol para a criopreservação de sêmen de suçuarana (Puma concolor)

O desenvolvimento de biotécnicas de reprodução é uma importante ferramenta para a conservação de animais silvestres ameaçados de extinção. Procedimentos de reprodução assistida em suçuarana, no entanto, são escassos na literatura, em especial aqueles relacionados à criopreservação de sêmen. Neste sentido, o presente trabalho objetivou avaliar a congelabilidade do sêmen de suçuaranas adultas mantidas em cativeiro, por meio da comparação entre duas concentrações de glicerol no meio de congelamento. Foram usados cinco machos adultos de suçuarana, mantidos no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do Mato Grosso do Sul (CRAS/MS). As amostras foram coletadas por eletroejaculação e avaliadas quanto ao seu aspecto físico, volume, vigor, motilidade, concentração e índice espermático. De cada ejaculado duas alíquotas foram diluídas em meio Tris-citrato-gema de ovo, em concentrações finais de 5 e 7,5% de glicerol, resfriadas a uma taxa de -0,55ºC/min e congeladas a uma taxa de -5,8ºC/min. Depois de descongeladas, as amostras foram reavaliadas e submetidas aos testes de termorresistência e hiposmótico. O protocolo de criopreservação e descongelamento de sêmen proposto se mostrou eficiente em ambas as concentrações de glicerol testadas, não havendo diferença (p>0,05) entre estas