Chitosan copolymers for intranasal delivery of insulin: synthesis, characterization and biological properties

Recently, chitosan has been extensively investigated as a promising carrier in the field of drug delivery. To overcome its poor solubility at physiological pH and the cytotoxicity of trimethyl chitosan, PEGylated trimethyl chitosan copolymers were synthesized and characterized systemically for the first time and their potential as insulin carriers for intranasal administration were studied. The use of chitosan as an absorption enhancer and gene delivery vehicle is molecular weight (MW) dependent. Therefore, we utilized an oxidative depolymerization method to prepare and investigate different MW chitosans. The MW of the depolymerized chitosan was influenced by the initial concentration and source of chitosan. The solubility of different MW chitosans was assayed as a function of pH. The cytotoxicity of different MW chitosan was studied with MTT assay using L929 cell line recommended by USP 26, showing that the cytotoxicity was concentration dependent, but virtually molecular weight independent. In an attempt to improve the solubility of chitosan at physiological pH, a two-step method was used to synthesis a series of trimethyl chitosans (TMC) with substitution degree of 40% using the different MW chitosans as starting materials. However, TMC was demonstrated to be toxic. Therefore, PEGylated TMC copolymers were synthesized to improve the biocompatibility of TMC. Solubility experiments demonstrated that PEG-g-TMC (400) copolymers were completely water-soluble over the entire pH range regardless of the PEG MW, even when the graft density was as low as 10%. Furthermore, the in vitro biocompatibility of PEGylated TMC copolymers was studied and compared with that of TMC. Using the MTT assay, the effect of TMC MW, PEGylation ratio, PEG and TMC MW in the copolymers, and complexation with insulin on the cytotoxicity of TMC was examined and the IC50 values were calculated accordingly with the L929 cell line. All of the polymers exhibited a time- and dose-dependent cytotoxic response that increased with MW. PEGylation decreased the cytotoxicity of TMC, to a great extent in the case of low MW TMC. According to cytotoxicity results, PEG 5 kDa is preferable for PEGylation compared to PEG 550 Da at similar graft ratio. Complexation with insulin increased cell viability after 24 h incubation. Additionally we performed a LDH assay to measure the membrane damaging effects of the copolymers on the basis of the results of the MTT assay. Moreover, examining the morphological changes of the cells under inverted phase contrast microscopy corroborated the safety of the copolymers. Polyelectrolyte-protein complexes (PEC) formation process between chitosan derivatives and insulin were studied and factors influencing the processes were investigated systemically. Turbidimetric titration in combination with dynamic light scattering (DLS) and laser doppler anemometry were applied to study the preferential binding between insulin and chitosan derivatives. Morphology of the complexes was observed with atomic force microscopy (AFM). It was demonstrated that the complex formation process was pH dependent. Binding between chitosan derivatives and insulin took place only above critical pH (pHc). Soluble complexes in the size range of 200-500 nm, which displayed a spherical or subspherical shape with smooth surface, could be obtained at optimized polymer/insulin charge ratio when the final system pH was in the range of 6.5-8.0, depending on polymer structure. Stability of the complex was polymer chain length dependent. Increasing the ionic strength of the medium accelerated complex dissociation. Conversely, high temperatures facilitated complex formation and compaction. Chitosan trimethylation and PEGylation significantly improved the stability of the complexes. The complexes could be lyophilized without affecting the complex properties. The uptake and transport of chitosan derivatives-insulin complexes in Caco-2 cells was studied and the mechanisms were delineated. Insulin uptake was enhanced by nanocomplex formation, and was incubation time, temperature and concentration dependent. Complex uptake in Caco-2 cells was inhibited significantly by cytochalasin D and marginally inhibited by metabolic inhibitors. The uptake mechanism was assumed to be adsorptive endocytosis. Additionally, the cell uptake efficiency was influenced by a combination of polymer molecular weight, viscosity and positive charge density. Complex internalization was further demonstrated by confocal microscopy. However, none of the nanocomplexes displayed improved transport properties when compared to insulin transport data after 2 h incubation with Caco-2 monolayers. In contrast, the complexes considerably enhanced insulin uptake or adhesion, with approximately 50% of insulin being attached or internalized in the cells after 2 h incubation, 3.5 fold higher compared with free insulin

Polyethylenimine- and lipid- based nanoparticles as gene and drug delivery systems for aerosol therapy to the lung

Inhalt dieser Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung verschiedener polymer- und lipid-basierter nanopartikulärer Formulierungen mit dem Ziel, diese bei der inhalativen Behandlung von Lungenerkrankungen einzusetzen zu können. Eine Reihe von Polyethyleniminen (PEI) wurde auf ihre Verwendbarkeit als nicht-virale biokompatible DNA- Transporter für eine Lungen-Gentherapie untersucht (Kapitel 2-5). Eine weitere Studie (Kapitel 6) verfolgte das Ziel Liposomen zu entwickeln, die für eine kontrollierte Wirkstofffreigabe nach Inhalation geeignet sind. Die Untersuchungen des Kapitels 2 stellen in dieser Dissertation, die Grundlage der Evaluierung von PEI als inhalierbare DNA Transporter zu dienen, dar. Es wurden vier verschiedene PEI-Modifikationen (verzweigtes, lineares, bioabbaubares & Polyethylenglycol-modifiziertes PEI) ausgewählt, die mit plasmidischer DNA (pDNA) Partikel in der Größenordnung von ca. 100 nm formten. Diese so genannten Polyplexe wurden hinsichtlich ihrer strukturellen und physikochemischen Veränderung während der Vernebelung mit einem Düsen- bzw. einem Ultraschallvernebler charakterisiert. Für diese Untersuchungen fanden verschiedene Techniken Anwendung, wie die Rasterkraftmikroskopie, die dynamische Lichtstreuung und die Laser Doppler Anemometrie. Damit konnten die Parameter Polyplex-Morphologie, Größe bzw. Zeta-Potential vor und nach den Vernebelungen bestimmt werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass die PEI Modifikationen, die am stärksten die pDNA komplexierten, die geringsten Veränderungen während der Vernebelung erfuhren. Dabei hatte das Polyethylenglycol-PEI (PEGPEI) die besten Eigenschaften hinsichtlich, DNA Komplexierung und Schutz bei der Vernebelung. Ein Vergleich der beiden Verneblersysteme ergab, dass alle Polyplexe am stabilsten während der Ultraschallverneblung waren. Als Schlussfolgerung dieser Studie, stellten wir die Ultraschall-Vernebelung als die geeignetere Methode für die Verabreichung von PEI-basierten Gentransfersystemen in die Lunge heraus. Des Weiteren sind die guten Stabilitätseigenschaften des PEGPEI hervorzuheben, auf Grund dessen wir in den darauf folgenden Studien PEGPEI als Vektor, neben dem Standartvektor verzweigtes 25 kDa PEI (BPEI), für die Pulmonale DNA Applikation verwendeten. Das Ziel der zweiten Studie (Kapitel 3) war die Entwicklung eines biokompatiblen und effizienten Systems für den Gentransport in die Lungen Epithelzellen. Dafür wurden zwei PEI Modifikationen verwendet, ein niedermolekulares PEI (LMWPEI) und das schon beschriebene PEGPEI, die mit dem Standart-Vektor BPEI verglichen wurden. Die Untersuchungen der Polyplex Morphologie (Rasterkraftmikroskopie), Größe (Dynamischer Lichtstreuung) und Zeta-Potential (Laser Doppler Anemometrie) zeigten, dass alle drei Polymere die pDNA vollständig kondensierten und mit dieser kleine, positiv geladene Partikel von ca. 100 nm formten. Zur Untersuchung der Polymer-Toxizität in vitro wurden MTT- und LDH-Assays durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass das LMWPEI die beste Biokompatibilität aufweist. Die Transfektionseffizienz der drei verschiedenen Vektoren wurde in vitro an einer Lungenepithelzelllinie und in vivo in Mäuselungen nach intratrachealer Instillation untersucht. Dabei wurde für LMWPEI im Vergleich zu BPEI und PEGPEI in vitro die geringste Genexpression detektiert, während die Transfektionsrate in der Mäuselunge für das LMWPEI am höchsten war. Interessanterweise beobachteten wir für PEGPEI ein genau gegensätzliches Verhalten und die sehr hohe Genexpression in der Zellkultur konnte in den Tierversuchen nicht reproduziert werden. Auf Grund dieser Beobachtungen stellten wir die Hypothese auf, dass eine gute Stabilität der Polyplexe im Mucus, im Surfactant und im Zellplasma, die Transfektion in vivo verändern könnten. Um dies zu untersuchen, wurden die Polyplexe mit Lavagen von Mäuselungen und mit natürlichem Surfactant inkubiert. Es konnte eine abnehmende Stabilität der Polyplexe in der Reihenfolge: PEGPEI > BPEI > LMWPEI beobachtetet werden. Daraus schlussfolgerten wir, dass starke Wechselwirkungen zwischen dem Polymer und der DNA in vivo zu einer schlechteren Freigabe der DNA führt und somit die Transfektionseffizienz verringert. Die Ergebnisse der Studie in Kapitel 3 zeigten, dass mittels LMWPEI im Tiermodel ein biokompatibler und effizienter Genvektor für die Lungentherapie entwickelt werden konnte. Diese viel versprechenden Ergebnisse gaben Anlass zu weiterführenden Studien über die Verträglichkeit von LMWPEI in der Mäuselunge (Kapitel 4). Dazu wurden die Polyplexe von LMWPEI im Vergleich zu BPEI und PEGPEI via Instillation in die Mäuselunge verabreicht und nach 48 Stunden wurden die Lungen lavagiert. Diese Lavagen wurden dann hinsichtlich Entzündungsfaktoren wie Gesamtzellzahl, Anzahl der Neutrophilen und der Makrophagen, Konzentration der Gesamtproteine und der Zytokine untersucht. Dabei wurden sowohl für die pDNA als auch die Polyplexe erhöhte Werte gemessen, diese konnten eingestuft werden in leichte Entzündungen bei der DNA und LMWPEI/DNA, mittlere Lungenentzündung bei BPEI/DNA und starke Lungenentzündung bei PEGPEI/DNA. Die Betrachtung dieser Ergebnisse im Zusammenhang mit den Transfektionsraten führte uns zu der Schlussfolgerung, dass mit zunehmender Toxizität in der Mäuselunge (LMWPEI BPEI > PEGPEI) abnimmt. Folglich wählten wir das LMWPEI für weitergehende Versuche zur Aerosolapplikation in die Lunge aus. Dafür entwickelten wir ein neues Inhalationssystem für Mäuse. Bedauerlicherweise nahmen die Transfektionsraten von LMWPEI/DNA nach der Vernebelung im Vergleich zur Instillation um den Faktor 50 ab. Um den Grund für diese drastische Abnahme zu erkunden, stellten wir Polyplexe her, bei denen sowohl die pDNA als auch das LMWPEI fluoreszenzmarkiert waren und verglichen deren Lungenverteilung nach Instillation mit der nach Inhalation. In den Konfocale Fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der Lungenschnitte zeigte sich, dass die vernebelten Polyplexe gleichmäßig in der Lunge verteilt waren, jedoch in sehr geringen Mengen. Im Gegensatz dazu waren die Polyplexe nach der Instillation in sehr hohen Konzentrationen sowohl in den Bronchien als auch in den Alveolen vorhanden, jedoch wurden nicht alle Abschnitte der Lunge erreicht. Des Weiteren beobachteten wir erstmalig, dass LMWPEI/DNA auch in die Lungenendothelzellen aufgenommen wurde. Zusammenfassend ergibt sich, dass LMWPEI ein sehr effizienter sowie biokompatibler Genvektor für die Lungentherapie ist, und diesbezüglich auch viel bessere Eigenschaften als das häufig eingesetzte BPEI aufweist. In einer weiteren Studie (Kapitel 5) ist die Entwicklung eines neuen Genvektors beschrieben, der mit einem TAT-Peptid (eine Proteintransduktionsdomaine) modifiziert wurde. Dazu wurde das TAT Peptid an BPEI über eine PEG-Kette kovalent gebunden. Dieses neue PEI Konjugat wurde, wie schon die zuvor beschriebenen Vektoren, hinsichtlich Kondensation der pDNA, Schutz der pDNA im extra- und intrazellulärem Lungenmilieu, Polyplexgröße, Stabilität, Zeta-Potential, in vitro und in vivo Transfektionseffizienz sowie Toxizität und Verteilung der Polyplexe in der Mäuselunge untersucht. Unser Ziel war es gewesen, einen nicht toxischen und sehr effizienten Genvektor zu entwickeln. Dies konnte mit dem neuem TAT-PEG-PEI weitgehend erreicht werden. Dieses Konjugat war in der Lage, sehr kleine und stabile Partikel mit pDNA zu formen. In der Mäuselunge wurde für die TAT-PEG-PEI Polyplexe ein Anstieg der Genexpression von ~600 % im Vergleich zu BPEI und ~300 % im Vergleich zu LMWPEI beobachtet. Weiterhin konnten wir eine hervorragende Verträglichkeit in vivo feststellen, und die Werte der Indikatoren eine Entzündungsrektion lagen im Bereich derer von pDNA. Ein weiterer Vorteil von TAT-PEG-PEI war der sichere Transport der pDNA in die verschiedenen Zellentypen der Lunge. Aus diesem Grund könnte dieser neu Genvektor für die Behandlung verschiedener Lungenerkrankungen eingesetzt werden, bei der verschiedenste Zelltypen betroffen sind, wie z.B. beim Lungenkrebs. Das wichtigste Ergebnis dieser vier beschriebenen Studien ist, dass TAT-PEG-PEI undim geringerem Maße auch LMWPEI als gut verträgliche und effiziente Vektoren das Potential besitzen, in der Gentherapie verschiedener Lungenerkrankungen Anwendung zu finden. Selbstverständlich sind weitergehende Studien notwendig, um die zwar geringe aber doch vorhandene Toxizität der Polyplexe weiter zu reduzieren. Dieses Ziel könnte beispielsweise erreicht werden, indem man für die Synthese von TAT-PEG-PEI das LMWPEI oder ein hochsubstituiertes PEGPEI verwendet. Des Weiteren sollte die Aufnahme von TAT-PEG-PEI Polyplexen in die Zelle genauer untersucht werden, da bisher widersprüchliche Studien über die Aufnahme und den Weg des TAT Peptides in der Zelle existieren. Weitergehende Studien hinsichtlich zellspezifischer Genvektoren sollten durchgeführt werden. Es wäre z.B. möglich, das LMWPEI mit einer zielgerichteten Struktur zu modifizieren, wie z.B. Lectin, Folat, einem Antikörper oder Peptiden wie z.B. das RGD. Der nächste Schritt sollte dann darin bestehen, therapeutische Gene (IL-12, p53, NO oder Prostacyclin Produzenten) mittels der optimierten Vektoren TAT-PEG-PEI und LMWPEI in die Lungenzellen zu transportieren. Des Weitern sollte versucht werden, das Vernebelungssystem für die in vivo Versuche zu verbessern, z.B. durch einen so genannten „Trocknenden Spacer“, wie er kürzlich von Rudolph et al. (2005) beschrieben wurde. Die fünfte Studie dieser Arbeit (Kapitel 6) beschreibt lipid-basierte Formulierungen als inhalierbare Drug Delivery Systeme. Der Wirkstoff Iloprost ist zugelassen in der Aerosoltherapie der Arteriellen Pulmonalen Hypertonie. Jedoch ist die Wirksamkeit dieses Stoffes begrenzt durch seine kurze Halbwertszeit. Infolgedessen war das Ziel der Studie die Entwicklung einer Formulierung, die Iloprost über einen verlängerten Zeitraum freisetzt. Solch eine Formulierung sollte beides gewährleisten: eine hohe Wirkstoffverkapselung und Stabilität während der Vernebelung. Dazu wurden verschiedene Lipidkombinationen für die Herstellung von Liposomen untersucht. Zuerst wurde die Modellsubstanz Carboxyfluorescein in Liposomen verkapselt, die aus Dipalmitoyl-phosphatidylcholin (DPPC) und Cholesterol (CH), oder aus DPPC, CH und PEG-dipalmitoyl-phoshatidylethanolamine (DPPE-PEG), bestanden. Die Stabilität dieser Liposomen wurde an drei verschiedenen Verneblern untersucht: Düsen-, Ultraschall- und Mikropumpenvernebler. Diese Systeme wurden hinsichtlich der Menge an produziertem Aerosol, der Aerosoltropfengröße und deren Einfluss auf die Liposomen verglichen. Dabei wurde die Stabilität der Liposomen in Bezug auf Liposomengröße und der Wirkstoffverkapselung, jeweils vor und nach der Vernebelung beurteilt. Es stellte sich heraus, dass die DPPC/CH Liposomen am stabilsten waren, insbesondere nach der Vernebelung mit dem Ultraschall- und dem Mikropumpenverneblern. In einer zweiten Versuchsreihe wurden die Liposomen mit Iloprost beladen. Dabei wurde die höchste Stabilität und Verkapselungseffizienz ebenfalls für die DPPC/CH Liposomen vor allem nach der Mikropumpenverneblung gefunden. Demzufolge schlussfolgerten wir, DPPC/CH Liposomen sind als eine Formulierung mit verlängerter Wirkstofffreigabe in der Behandlung der pulmonalen Hypertonie gut geeignet. Bis dieses Ziel erreicht werden kann, sind jedoch noch viele weiterführende Untersuchungen notwendig, und die hier präsentieren Ergebnisse stellen erst den Grundstein dafür dar. Als nächste Schritte sollten die Aufnahme der Liposomen in Lungenepithelzellen bzw. die Wirkstofffreisetzung untersucht werden, gefolgt von pharmakokinetischen ex vivo Studien. Danach sollte die Wirksamkeit der Iloprost-Liposomen an einem Tiermodel untersucht werden, bei dem, z.B. ausgelöst durch die Haltung in Hypoxie, eine pulmonale Hypertonie besteht. Die neuen Formulierungen und Technologien, die in dieser Dissertation beschrieben sind, stellen zwar nur einen kleinen, aber dennoch wichtigen Fortschritt in der Entwicklung von neuen Therapieformen für die Behandlung von Lungenerkrankungen dar. Derartige Formulierungen geben Anlass zur Hoffnung eines Tages die Behandlung von schwerkranken Patienten deutlich zu verbessern

Charge modified, comb-like graft-polyesters for drug delivery and DNA vaccination: Synthesis and Characterization of Poly(vinyl dialkylaminoalkylcarbamate-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)-graft-poly(D,L-lactide-co-glycolide)s

In the present thesis a novel tailor-made polyester class based on amine-modified backbones and PLGA side chains was synthesized after designing its chemical structure under consideration of all necessary assumptions for a drug delivery system. Varying side chain length and amine substitution these polyesters can be especially designed for drug delivery problems. Their structure was clarified by NMR-spectroscopy and GPC-MALLS (multi-angle-laser-light-scattering). By variation of side chain length and /or amine substitution the solution and thermal behavior could be adjusted. Aimed amine substitution could be used to control degradation speed of the polyesters. Grafting of short side chain onto amine modified PVA converted a pure bulk erosion into a mixed surface and bulk erosion. To our knowledge this is the first time a degradation time of PLGA polyesters smaller than 15 days could be reached and could be freely modified by changing side chain length and amine substitution. Due to their solution and thermal behavior this polymer class is suitable for manufacturing of microparticles and implants. Using two dimensional NMR techniques like 1H-1H COSY, 1H-13C HMBC and 1H-13C HMQC a clear assignment of 1H and 13C NMR signals of the amine modified PVAs was established. The microstructure of the PVA backbones was investigated. It was demonstrated that some of the synthesized Polyesters have interesting transfection abilities in in-vitro experiments on L929 mouse fibroblasts. Especially, the particles formed by P(68)-10 feature an extraordinary high transfection even higher than that of PEI/DNA complexes. Holding the side chain length constant it was possible to increase transfection by increasing the amine substitution of the backbone. An opposite effect results at constant amine substitution and elongation of the PLGA chains

Insulin nanocomplexes formed by self-assembly from amine-modified poly(vinyl alcohol)-graft-poly(L-Lactide) for non-invasive mucosal delivery: Preparation, characterization and in vivo investigations

In this work biodegradable DEAPA-PVAL-g-PLLA nanocomplexes were investigated as a colloidal peptide carrier system for non-invasive transmucosal insulin delivery. Chapter 1 describes the basic fundamentals of insulin therapy, current status, problems and future trends. The pathogenesis of diabetes mellitus and the different treatment options are discussed to give an understanding of the necessity for alternative non-invasive application systems. It was emphasized that epithelial barriers and enzymatic degradation prevent effective transmucosal insulin delivery. The potential of colloidal bioadhesive polymeric carriers for oral, pulmonal or nasal application of insulin were discussed. The factors bioadhesivity and complexing-capability of polymers were considered with regard to literature. Reference was made to other fields where charge modified grafted polyester of theses novel class were already succesfully utilized for drug delivery. In Chapter 2 the DEAPA-PVAL-g-PLLA polymers were characterized for their substitution degree of amine-groups and the extent of lactide grafting. It was possible to manipulate the hydrophilic-hydrophobic balance of these polyesters by factors such as molecular weight, PLLA chain lengths and degree of amine-substitution. Water solubility of these polymers allowed the spontaneous self-assembling with insulin to small nano-sized complexes with narrow size distribution. The formulation of nanocomplexes made of polymers with varying structural composition were characterized for various physico-chemical characteristics, such as size distribution, surface charge and insulin association efficiency. Studies with isothermal titration calorimetry demonstrated the influence of the structural architecture on binding constants. An increase in binding affinity, drug loading, zeta potential and a decrease of complex size could be correlated with a higher substitution degree of DEAPA groups and a higher lactic acid grafting of the backbone. Systemic investigations of the complexation process, using nephelometric and light scattering techniques, allowed the evaluation of an optimal ratio of the binding partners. The complexes visualized by atomic force microscopy revealed a homogeneous particle collective with spheroidal complexes exhibiting an entangled internal structure. In Chapter 3 the suitability of insulin containing DEAPA-PVAL-g-PLLA nanocomplexes as a nasal insulin delivery system was studied under in-vivo conditions at wistar rats. Changes in blood glucose and insulin concentration were monitored in anaesthetized rats using a glucose meter and ELISA. The blood glucose response revealed a significant decrease of glucose concentration, which was accompanied by an increase of exogenous insulin concentration in rat blood. From the investigated two different NC options, the more amphiphilic variant with grafted lactic acid side chains was superior to the more hydrophilic backbone with no additional grafting. The pharmacological response observed in healthy rats was reproduced on streptozotocin induced diabetic rats, demonstrating in-vivo effectivness in diseased subjects respectively. A significant increase in relative bioavailability was observed at higher polymer concentrations for the grafted variant. The histological examination of the nasal mucosa with light microscopy showed no signs of toxicity on nasal morphology at the site of application after a single administration procedure. In Chapter 4 the interaction of DEAPA-PVAL-g-PLLA nanocomplexes with enterocyte-like Caco-2 cells in terms of cytotoxicity, transport through and uptake in the cell layers was investigated. The NC were compared against a nanoparticle formulation based on a higher grafted variant of DEAPA- PVAL-g-PLGA and prepared by a solvent displacement technique. The preformulated NP were loaded with insulin by surface adsorption. The comparison of permeability enhancing effects of nanocomplexes with the nanoparticle formulation, showed no significant differences. However, nanocomplexes physico-chemical properties and interaction with Caco- 2 monolayers varied strongly as a function of the polymer structural composition. The most effective carrier posses a combination of a hydrophilic backbone and hydrophobic side chains. On the other hand, this combination led to a higher amphiphilic, surfactant-like character of the polymer, which probably caused damages to membrane and tight junctions, as indicated by lactate dehydrogenase release and decrease of transepithelial resistance. However, since these effects seemed to be reversible and NC with a higher lactide-grafting showed the best protection capabilities against trypsinic degradation, the highest internalization and transport through Caco-2 monolayers, it may be assumed that these NC are suitable carriers for insulin to overcome mucosal absorption barriers

Microparticular and Nanoparticular DNA Delivery Systems as Adjuvants for DNA Immunization

In this dissertation different microparticular and nanoparticular DNA carrier systems were developed, with the aim to create an efficient adjuvant system for DNA vaccination. Their suitability was investigated by physico-chemical parameters, such as particle size, z-potential and encapsulation efficiency. Further, the systems were studied in-vitro for DNA stabilization and DNA bioactivity after encapsulation and release, as well as for gene delivery. We investigated modified double emulsion methods and spray drying techniques for DNA microencapsulation. Firstly, DNA was complexed with polyethylenimine (PEI) 25 kDa. We further studied the possibility to encapsulate lyophilized DNA and lyophilized DNA / PEI complexes in the presence of lyoprotectants. The microparticles were formulated using i) a modified double emulsion technique (W/O/W), ii) a solid in oil in water method (S/O/W), iii) a water in oil spray drying technique (W/O) and iv) a solid in oil spray drying technique (S/O). DNA release from particles prepared with double-emulsion methods, in contrast to spray drying techniques, resulted in constant DNA release and relatively low initial burst effects. The complexation with PEI substantially retarded the DNA release for all preparation techniques. In Chapter 4, we adsorbed DNA onto the surface of microparticles. We developed a cationic microparticular system by the incorporation of different amounts of the cationic molecules, PEI or CTAB into the polyester matrix. PEI 10% microparticles exhibited the most promising characteristics, such as a small particle size, a high z-potential of + 47 mV, a high DNA adsorption efficiency for a theoretical loading of 1% over the physiological pH range. The mechanism of gene delivery was studied by confocal microscopy and revealed diffuse fluorescence of DNA and PEI in the cytoplasm of non-phagocytic L929 fibroblasts. This was attributed to polyplex formation after PEI release from the particle. The efficient gene transfer of RG 502H+PEI 10% microparticles was confirmed by luciferase transfection. The challenge experiments with a lethal dose of the pathogen in challenge experiments in mice demonstrated that the formulation had an adjuvant effect. In Chapter 5, a new polymeric system was designed, consisting of poly (vinyl-alcohol) coupled with diamines, such as diethylaminopropylamine (DEAPA), (DMAPA) or (DEAEA). The amphiphilic properties allowed the formulation of DNA nanoparticles by a modified solvent displacement technique without the use of shear forces. DNA nanoparticles exhibited positive z-potentials up to +42 mV. The gene delivery of the nanoparticles was assessed in L929 mouse fibroblasts, which demonstrated high transfection efficiencies, comparable to PEI 25kDa/DNA complexes at a nitrogen to phosphate ratio of 5. In Chapter 6 we chose one representative polymer, P(26)-10, of the new class of amine-modified polyesters to investigate the influence of several process parameters on the nanoparticle formation. In Chapter 7, DNA nanoparticles with amine-modified polyesters were further characterized using two classes of polymers (DEAPA /DEAEA) with different amounts of amine modifications. The nanoparticle x-potentials and sizes were dependent on the N/P ratio. Atomic force microscopy confirmed the small particle sizes. DNA stability during the encapsulation process and release over nine day was demonstrated by electrophoresis, as well as DNA protection from enzyme degradation in dependence of the N/P ratio. The amount of cellular uptake of an efficient candidate P(68)-10, DNA nanoparticles was shown to be dependent on the N/P ratio of the formulation by flow cytometry. The mechanism of cellular uptake was followed by confocal microscopy and exhibited endocytotic uptake of the particles. The very efficient gene delivery of the P(68)-10 polymer was demonstrated by in-vitro transfection assays in four cell lines compared to PEI / DNA complexes at equal N/P ratios

Erzeugung und Charakterisierung zielgerichteter liposomaler Trägersysteme für die Tumortherapie

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, drei neue liposomale Systeme für die zielgerichtete Tumortherapie zu entwickeln. Dafür wurden liposomale Oberflächen mit Zielsteuerungsmotiven, die mittels der Phage-Display-Technologie erzeugt wurden, modifiziert. Für das vaskuläre Targeting wurden als Liganden ein gegen Endoglin gerichtetes humanes scFv-Fragment und ein gegen die alpha-v-Integrine gerichtetes RGD-Peptid verwendet. Als Zielsteuerungsmotiv für den auf Tumorzellen lokalisierten EGF-Rezeptor diente ein derivatisiertes humanes EGF-Protein. Während das scFv-Fragment über eine Thioetherbindung an Maleimid-haltige Liposomen und das EGF-Protein über eine Carbonsäureamidbindung an N-hydroxysuccinimid-haltige Liposomen gerichtet gekoppelt werden konnte, wurde das RGD-Peptid als Lipopeptid in die liposomale Membran integriert. Die liposomalen Systeme wurden zuerst physiko-chemisch analysiert. Mittels in vitro-Studien konnte demonstriert werden, daß alle drei zielgerichteten liposomalen Systeme selektiv an die jeweiligen Zielzellen gebunden haben und von diesen aufgenommen wurden. Darüber hinaus wurde durch Kompetitionsexperimente nachgewiesen, daß die Bindung an die Zielzellen bzw. die Aufnahme in diese spezifisch über den jeweiligen Liganden vermittelt wurde. Die mit dem scFv-Fragment modifizierten und mit Doxorubizin beladenen Liposomen zeigten im Vergleich zu den gleichen Liposomen ohne Zielsteuerungsmotiv eine erhöhte in vitro-Zytotoxizität. Die gegen die alpha-v-Integrine gerichteten und mit Doxorubizin beladenen Liposomen konnten auch im Tierversuch das Tumorwachstum - verglichen mit den gleichen nicht-zielgerichteten Liposomen - stärker inhibieren. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde erfolgreich das Zytostatikum Cytarabin in eine neue liposomale Formulierung verpackt. Mittels dieser Liposomen konnte - verglichen mit freiem Cytarabin - eine signifikant verstärkte Inhibierung des Tumorwachstums im Tierversuch nachgewiesen werden

Biodegradable Paclitaxel-loaded Nanoparticles and Stent Coatings as Local Delivery Systems for the Prevention of Restenosis

Despite improved technologies restenosis remains the main problem of catheter-based interventions after a percutaneous transluminal angioplasty in artery disease. Local and sustained application of antiproliferative agents is a promising approach to solve the problem of intimal hyperplasia. In recent years, two different concepts for local drug delivery have attained increased importance: On the one hand, colloidal drug carriers, which can be infused directly into the vessel wall during the angioplasty procedure using special delivery catheters and on the other hand, the development of drug eluting stents. Biocompatible, biodegradable polymers are one of the most important instruments used to control the release of pharmacological active substances. A new type of branched, biodegradable polyesters, poly(vinyl alcohol)-graft-poly(lactide-co-glycolide) (PVA-g-PLGA), possesses very interesting features for the local and sustained release of paclitaxel. Therefore, the objective of this work was to investigate these polymers with regard to the preparation of paclitaxel loaded nanoparticles and stent coatings, and to evaluate their applicability as drug carriers to prevent intimal hyperplasia

Toxicity of Polymeric-Based Non-Viral Vector Systems for Pulmonary siRNA Application

no Abstrac

Blip glitches in Advanced LIGO data

Blip glitches are short noise transients present in data from ground-based gravitational-wave observatories. These glitches resemble the gravitational-wave signature of massive binary black hole mergers. Hence, the sensitivity of transient gravitational-wave searches to such high-mass systems and other potential short duration sources is degraded by the presence of blip glitches. The origin and rate of occurrence of this type of glitch have been largely unknown. In this paper we explore the population of blip glitches in Advanced LIGO during its first and second observing runs. On average, we find that Advanced LIGO data contains approximately two blip glitches per hour of data. We identify four subsets of blip glitches correlated with detector auxiliary or environmental sensor channels, however the physical causes of the majority of blips remain unclear