Hemodialysis Removes Uremic Toxins That Alter the Biological Actions of Endothelial Cells

Chronic kidney disease is linked to systemic inflammation and to an increased risk of ischemic heart disease and atherosclerosis. Endothelial dysfunction associates with hypertension and vascular disease in the presence of chronic kidney disease but the mechanisms that regulate the activation of the endothelium at the early stages of the disease, before systemic inflammation is established remain obscure. In the present study we investigated the effect of serum derived from patients with chronic kidney disease either before or after hemodialysis on the activation of human endothelial cells in vitro, as an attempt to define the overall effect of uremic toxins at the early stages of endothelial dysfunction. Our results argue that uremic toxins alter the biological actions of endothelial cells and the remodelling of the extracellular matrix before signs of systemic inflammatory responses are observed. This study further elucidates the early events of endothelial dysfunction during toxic uremia conditions allowing more complete understanding of the molecular events as well as their sequence during progressive renal failure

Uremic toxins increase MMP-2 and MMP-9 activity and alter basic biological functions of cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)

End-stage renal disease (ESRD) is accompanied by accumulation of several uremic toxins leading to major metabolic and inflammatory disturbances. Endothelial cells are one of the major targets of uremic toxins causing dysfunction vascular remodeling and atherosclerosis. Primary cultures from human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), incubated with serum from ESRD patients before (predialysis) and after (postdialysis) a 4h regular dialysis session were used. Basic biological functions of endothelial cells like proliferation migration wound healing as well as apoptosis were studied. In addition expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-1 TIMP-2 elastin and collagen type IV was also investigated. Cell proliferation was determined with crystal violet method apoptosis with flow cytometry and cell migration with transwell system. Zymograms were used to detect MMP-2 and MMP-9 activity. Western Blot analysis for TIMP-1 and TIMP-2 protein expression and RT PCR was performed for MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 elastin and collagen type IV mRNA detection. Results: Incubation of HUVEC with predialysis serum results in reduced proliferation cell migration and wound healing capacity as well as increased apoptosis compared to incubation with postdialysis serum. Predialysis serum also upregulates MMP-2 and MMP-9 and downregulates TIMP-1 and TIMP-2 expression and decreases both elastin and collagen type IV (mRNA and protein) compared to postdialysis serum. Conclusions: Uremic serum alters basic biological functions of endothelial cells and causes an imbalance between synthesis and degradation of extracellular matrix components. The endothelial dysfunction that is in part improved by dialysis is probably related to vascular remodeling observed in patients with ESRD.Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο προσδιορισμός του βαθμού βελτίωσης των εν δυνάμει διαταραχών των κυτταρικών συστημάτων κατά την εφαρμογή συνεδρίας αιμοκάθαρσης. Ως πειραματικό μοντέλο θεωρήσαμε καταλληλότερο το in vitro σύστημα από ανθρωπινά ενδοθηλιακά κύτταρα από ομφάλια φλέβα (HUVEC). Στις καλλιέργειες των κυττάρων επέδρασε ουραιμικός ορός πριν (προ ορός) και μετά (μετά ορός) από συνέδρια αιμοκάθαρσης. Ο ορός ελήφθη από 10 ασθενείς που υποβάλλονταν σε υποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας με τετράωρες συνεδρίες αιμοκάθαρσης τρεις φορές εβδομαδιαίως. Ο ορός ελήφθη πριν και μετά τις συνεδρίες αιμοκάθαρσης προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του ουραιμικού περιβάλλοντος με μεγαλύτερη και μικρότερη συγκέντρωση ουραιμικών τοξινών αντίστοιχα στις βιολογικές λειτουργίες των υγιών ενδοθηλιακών κυττάρων. Χρησιμοποιήθηκε ορός σε συγκέντρωση 5-20% και η διάρκεια επώασης ήταν 12-72 ώρες. Μελετήθηκαν βασικές βιολογικές λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων (πολλαπλασιασμός μετανάστευση απόπτωση επούλωση τραύματος). Επιπλέον μελετήθηκε το σύστημα των μεταλλοπρωτεϊνασών ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 και των αναστολέων τους ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης καθώς και η έκφραση του κολλαγόνου τύπου IV και της ελαστίνης προκειμένου να διευκρινιστούν οι αλλαγές που υφίσταται το μικροπεριβάλλον των ενδοθηλιακών κυττάρων υπό την επίδραση υψηλών και χαμηλών συγκεντρώσεων ουραιμικών τοξινών. Στα τελευταία in vitro πειράματα μελετήθηκε η έκφραση VCAM-1 και ICAM-1, μόρια τα οποία έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στη φλεγμονή και στη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου. Διαπιστώθηκε πως ο ορός προ της θεραπείας με αιμοκάθαρση είναι τοξικός γιατί καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών ενδοθηλιακών κυττάρων, ενώ το ίδιο δε συμβαίνει κατά την επώαση των κυττάρων με ορό ατόμων με φυσιολογική νεφρική λειτουργία. Επιπλέον, μελετήθηκαν συγκριτικά οι προαναφερθείσες λειτουργίες των κυττάρων μετά την επίδραση ορού πριν και μετά από συνέδρια αιμοκάθαρσης και διαπιστώθηκε πως μετά την απομάκρυνση τοξικών ουσιών με 4ωρη συνεδρία αιμοκάθαρσης, βελτιώθηκε η λειτουργία των κυττάρων αποκαθιστώντας σε σημαντικό βαθμό το ρυθμό πολλαπλασιασμού, την ικανότητα μετανάστευσης και επούλωσης τραύματος, ενώ το ποσοστό απόπτωσης μειώθηκε μετά την αιμοκάθαρση. Όσον αφορά την εξωκυττάρια ουσία και το σύστημα μεταλλοπρωτεϊνασών, καθώς και την παραγωγή ελαστίνης και κολλαγόνου τύπου IV, διαπιστώθηκε πως ο ορός πριν την αιμοκάθαρση επάγει την παραγωγή ΜΜ-2 και ΜΜΡ-9 σε σχέση με τον ορό μετά την αιμοκάθαρση, ενώ το αντίθετο συμβαίνει με τους αναστολείς τους ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2. Αύξηση της παράγωγης ελαστίνης και κολλαγόνου παρατηρήθηκε με την επίδραση ορού μετά την αιμοκάθαρση. Η αυξημένη δραστικότητα των MMPs με την ταυτόχρονη μείωση της έκφρασης των βασικών συστατικών της εξωκυττάριας ύλης (κολλαγόνου τύπου IV, ελαστίνης) οδηγεί στην καταστροφή του εξωκυττάριου στρώματος πάνω στο οποίο τα ενδοθηλιακά κύτταρα εγκαθίστανται ώστε να διατηρούν την ομοιόστασή τους. Συμπερασματικά, επομένως, μπορούμε να πούμε πως ο ουραιμικός ορός στο σύνολό του επηρεάζει βασικές βιολογικές δράσεις των κυττάρων, ενώ ξεκάθαρα φαίνεται η ευνοϊκή επίδραση της αιμοκάθαρσης

Effect of pre- or post-HD serum on the expression of TIMP-1 and TIMP-2.

<p>(A): HUVEC were incubated in culture medium supplemented with 20% pre- or post- HD serum. 4 h later the medium was replaced by minimal medium and 8 h or 20 h later the supernatants were analyzed for TIMP-1 and TIMP-2 proteins by SDS-PAGE. (B): HUVEC were incubated with culture medium supplemented with 20% pre- or post- HD serum. 6, 12, or 24 h later total RNA was extracted from the cells, RT-PCR reactions were performed using specific primers for TIMP-1, TIMP-2 or GAPDH mRNAs, the PCR products were analyzed in agarose gels and quantified. Data are expressed as mean ± SEM of three independent experiments. ^* and ^** represent p<0.05 and p<0.01 respectively.</p

Effect of pre- or post-HD serum on MMP-2, -9 expression.

<p>(A): HUVEC were incubated in medium supplemented with 5%, 10%, 20% pre- or post- HD serum. 4 h later the medium was replaced by minimal medium and 20 h later the supernatants were analyzed for MMP-2 and MMP-9 activity by zymography. (B): HUVEC were incubated with culture medium supplemented with 20% pre- or post- HD serum. 4 h later the medium was replaced by minimal medium and 8 or 20 h later the supernatants were analyzed for MMP-2 and MMP-9 activity by zymography. (C): HUVEC were incubated in culture medium supplemented with 20% pre- or post- HD serum. 6, 12, or 24 h later total RNA was extracted from the cells, RT-PCR reactions were performed using specific primers for MMP-2, MMP-9 or GAPDH mRNAs, the PCR products were analyzed in agarose gels and quantified. Data are expressed as mean ± SEM of three independent experiments.. ^*, ^** and ^*** represent p<0.05, p<0.01 and p<0.001 respectively.</p

Effect of pre- or post-HD serum on the expression of collagen-IV and elastin.

<p>HUVEC were incubated with culture medium supplemented with 20% pre- or post- HD serum. 6, 12, or 24 h later total RNA was extracted from the cells, RT-PCR reactions were performed using specific primers for Collagen IV, Elastin or GAPDH mRNAs, the PCR products were analyzed in agarose gels and quantified. Data are expressed as mean ± SEM of three independent experiments. ^*, ^** and ^*** represent p<0.05, p<0.01 and p<0.001 respectively.</p