A flotillin-1 fehérje, mint a protein foszfatáz 2A új kölcsönható partnerének vizsgálata

A szerin-treonin (Ser/Thr) specifikus foszfatázok csoportjába tartozó protein foszfatáz 2A (PP2A), szerkezeti felépítését tekintve három alegységből áll. Az A szerkezeti és a C katalitikus alegység dimerjéhez, egy harmadik úgynevezett B regulátor alegység (PP2A B) kapcsolódik. A különféle B alegységek a holoenzimek szubsztrátspecificitását és a sejten belüli lokalizációját határozzák meg. Munkacsoportunk korábban tüdő artéria endotél sejtekből végzett pull down kísérletből származó minta tömegspektrometriás analízisével, a flotillin-1 fehérjét, mint a rekombináns GST-PP2A Bα fehérje új kölcsönható partnereként azonosította. A flotillin fehérjék a sejtfelszíni receptorok és a citoszkeleton közötti kapcsolat létrehozásában, jelátviteli folyamatokban részt vevő membránfehérjék. Jelenlegi munkánk célja volt, a PP2A holoenzim és flotillin-1 fehérje kölcsönhatásának további vizsgálata, melyhez az alábbi kísérleteket terveztük elvégezni. Tüdő artéria endotél sejtekből készített cDNS felhasználásával a flotillin-1 szekvenciájának felsokszorosítása szubklónozásra alkalmas primerekkel, majd a pGEX-4T-2-flotillin-1 rekombináns plazmid létrehozása. A rekombináns GST-flotillin-1 termeltetésének optimalizálása eltérő IPTG koncentráció és hőmérséklet alkalmazásával. A tisztított GST-flotillin-1 és PP2A holoenzim közti kölcsönhatás vizsgálata pull down kísérletben endotél sejtek felhasználásával. Az endogén PP2A Bα és flotillin-1 kölcsönhatásának kimutatása immunprecipitáció elvégzésével és a kölcsönhatás sejten belüli lokalizációjának vizsgálata immunfluoreszcens kísérlettel. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy sikeresen előállítottuk a pGEX-4T-2-flotillin-1 rekombináns plazmidot, optimalizáltuk a GST-flotillin-1 fehérje termeltetését. A tisztított GST-flotillin-1 fehérje képes volt a PP2A holoenzim A, C és Bα alegységét pull down kísérletben megkötni. Az endogén fehérjék közötti kölcsönhatást immunprecipitációs és immunfluoreszcens kísérletekkel igazoltuk. A továbbiakban szeretnénk a PP2A Bα és flotillin-1 fehérjéket specifikus siRNS-ek felhasználásával depletálni az endotél sejtekben és a csendesítés hatását megvizsgálni.BSc/BABiológiag

Examination of flotillin-1, as a new substrate of protein phosphatase 2A

A protein foszfatáz 2A (PP2A) a Ser/Thr specifikus foszfatázok csoportjába tartozik. Szerkezetét tekintve három alegységből áll, melyek közül a változatos B alegység határozza meg a holoenzim szubsztrátspecificitását, valamint a sejten belüli lokalizációját. Munkacsoportunk korábban kimutatta, hogy az endotél sejtekben a flotillin-1 fehérje, a B55α regulátor alegységet tartalmazó PP2A holoenzimmel hat kölcsön. A kölcsönhatást a fehérjék ko-lokalizációjával, immunprecipitációval és pull down kísérletekkel igazoltuk. Irodalmi adatokból tudjuk, hogy a protein kináz C (PKC) enzim a flotillin-1 fehérjét a Ser315 oldalláncon foszforilálja. Jelenlegi munkánk célja volt annak vizsgálata, hogy a flotillin-1 lehet-e a PP2A szubsztrátja. Tüdő artéria endotél sejtekben siRNS technikával depletáltuk a PP2A regulátor Bα alegységét, melynek hatására a flotillin-1 a sejtmag körül dúsult fel. Ugyanezt a változást láttuk a PKC enzim aktiválásakor, valamint a PP2A okadánsavval történő gátlásakor is. Proximity ligation assay (PLA) módszerrel kimutattuk, hogy a PKC enzim aktivációjakor a flotillin-1 és PP2A Bα közötti kölcsönhatás sokkal kifejezettebb lett. Rekombináns DNS technikával létrehoztuk a flotillin-1 foszorilációt utánzó (S315D) és foszfonull (S315A) mutánsait. A kísérletekhez a flotillin-1 kódoló szakaszokat emlős expresszióra alkalmas pcDNA3.1/myc-His vektorba, míg a bakteriális expresszióhoz pGEX-4T-2 vektorba klónoztuk. Az endotél sejtekben optimalizáltuk a rekombináns fehérjék overexpresszióját, majd lokalizációjukat immunfluoreszcens festéssel, míg a PP2A Bα fehérjével való kölcsönhatásukat immunprecipitációs kísérletekkel ellenőriztük. Bakteriális expresszióval előállítottuk a GST-flotillin-1 mutáns fehérjéket, melyeket pull down módszerben használtunk fel. A kölcsönhatás kinetikai vizsgálatához az ún. NanoBiT rendszerrel tervezünk vizsgálatokat, amelyhez a szükséges rekombináns plazmidokat már létrehoztuk. Eredmények alapján elmondhatjuk, hogy az endotél sejtekben a flotillin-1 fehérje foszforiláció függő módon hat kölcsön a PP2A Bα holoenzimmel, valamint hogy a PKC által foszforilált flotillin-1 a PP2A enzim szubsztrátja lehet.MSc/MABiotechnológiaL

Protein phosphatase 2A-mediated flotillin-1 dephosphorylation up-regulates endothelial cell migration and angiogenesis regulation

Endothelial cells have key functions in endothelial barrier integrity and in responses to angiogenic signals that promote cell proliferation, cell migration, cytoskeletal reorganization, and formation of new blood vessels. These functions highly depend on protein-protein interactions in cell-cell junction and cell attachment complexes and on interactions with cytoskeletal proteins. Protein phosphatase 2A (PP2A) dephosphorylates several target proteins involved in cytoskeletal dynamics and cell adhesion. Our goal was to find new interacting and substrate proteins of the PP2A-B55α holoenzyme in bovine pulmonary endothelial cells. Using LC-MS/MS analysis, we identified flotillin-1 as a protein that binds recombinant GSH S-transferase-tagged PP2A-B55α. Immunoprecipitation experiments, proximity ligation assays, and immunofluorescent staining confirmed the interaction between these two endogenous proteins in endothelial cells. Originally, flotillins were described as regulatory proteins for axon regeneration, but they appear to function in many cellular processes, such as membrane receptor signaling, endocytosis, and cell adhesion. Ser315 is a known PKC-targeted site in flotillin-1. Utilizing phosphomutants of flotillin-1 and the NanoBiT luciferase assay, we show here that phosphorylation/dephosphorylation of Ser315 in flotillin-1 significantly affects its interaction with PP2A-B55α and that PP2A-B55α dephosphorylates phospho-Ser315 Spreading, attachment, migration, and in vitro tube formation rates of S315A variant-overexpressing cells were faster than those of nontransfected or S315D-transfected cells. These results indicate that the PP2A-flotillin-1 interaction identified here affects major physiological activities of pulmonary endothelial cells

Elongation factor-1A1 is a novel substrate of the protein phosphatase 1-TIMAP complex.

TIMAP (TGF-β inhibited membrane associated protein) is a protein phosphatase 1 (PP1) regulatory subunit highly abundant in endothelial cells and it is involved in the maintenance of pulmonary endothelial barrier function. It localizes mainly in the plasma membrane, but it is also present in the nuclei and cytoplasm. Direct interaction of TIMAP with the eukaryotic elongation factor 1 A1 (eEF1A1) is shown by pull-down, LC-MS/MS, Far-Western and immunoprecipitations. In connection with the so called moonlighting functions of the elongation factor, eEF1A is thought to establish protein-protein interactions through a transcription-dependent nuclear export motif, TD-NEM, and to aid nuclear export of TD-NEM containing proteins. We found that a TD-NEM-like motif of TIMAP has a critical role in its specific binding to eEF1A1. However, eEF1A1 is not or not exclusively responsible for the nuclear export of TIMAP. On the contrary, TIMAP seems to regulate membrane localization of eEF1A1 as the elongation factor co-localized with TIMAP in the plasma membrane fraction of control endothelial cells, but it has disappeared from the membrane in TIMAP depleted cells. It is demonstrated that membrane localization of eEF1A1 depends on the phosphorylation state of its Thr residue(s); and ROCK phosphorylated eEF1A1 is a novel substrate for TIMAP-PP1 underlining the complex regulatory role of TIMAP in the endothelium. The elongation factor seems to be involved in the regulation of endothelial cell attachment and spreading as silencing of eEF1A1 positively affected these processes which were monitored by transendothelial resistance measurements