Detecção de mutações no gene CFTR em pacientes com suspeitas de fibrose cística

A fibrose cística (FC) é uma doença genética autossômica recessiva de alta incidência em populações euro-descendentes (1: 2500 nascimentos) causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Aproximadamente 2.000 mutações foram descritas, sendo a mais prevalente F508del. Estas mutações causam disfunções na proteína CFTR que regula as passagens de cloro e de sódio através da membrana celular, conduzindo a diferentes graus de manifestações clínicas. Atualmente, no Rio Grande do Sul (RS), apenas o estudo molecular para a mutação F508del é realizada. Portanto, é necessário a busca por métodos moleculares que possibilitem a detecção de outras mutações. O objetivo principal desse estudo foi implementar uma metodologia molecular para a detecção de 11 mutações (R1162X, G85E, R117H, 2789 + 5G> A, G542X, R334W, W1282X, R553X, 1717-1G>A, 3120-1G>A e G551D) no gene CFTR, utilizando a extensão de base única (SNaPshot), e aplicá-la em uma população com suspeita de FC (teste do suor alterado ou limítrofe ou com a mutação F508del detectada). O material genético foi extraído a partir de sangue total de 34 pacientes com suspeita de FC através da técnica de salting-out. As frequências alélicas das mutações encontradas por SNaPshot foram: G542X (5,9%), R334W (1,5%), W1282X (2,9%), 3120-1G>A (2,9%). Os genótipos encontrados, levando em consideração o complemento de informações de F508del foram: 9 (26,5%) F508del/desconhecido, 2 (5,9%) G542X / F508del, 1 (2,9%) 3120-1G>A / F508del, 1 (2,9%) R334W / F508del, 1 (2,9%) G542X / G542X, 1 (2,9%) 3120-1G>A /desconhecido, 1 (2,9%) W1282X/F508del e 1 (2,9%) W1282X/desconhecido. Adicionalmente, foi realizada a detecção da mutação F508del em pacientes com suspeita de FC que vieram a óbito durante a triagem, além da padronização de uma técnica para extração de DNA a partir de sangue seco em papel filtro S&S 903. Noventa e três pacientes com IRT maior do que 70 ng/mL foram estudados. A frequência de 2,15% destes pacientes apresentou a mutação F508del em heterozigose. Através do estudo desenvolvido foi possível padronizar um método de detecção molecular de 11 mutações no gene CFTR que, uma vez implantado na rotina do Serviço de Referência de Triagem Neonatal, permitirá um melhor direcionamento do tratamento, aconselhamento genético, prognóstico e qualidade de vida dos pacientes.Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive genetic disease of high incidence in euro-descendant populations (1: 2500 live births) and is caused by mutations in the CFTR gene (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Approximately 2,000 mutations have been identified, F508del being the most prevalent. These mutations cause dysfunctions in the CFTR protein that regulates the passages of chloride and sodium across cell membranes, leading to different degrees of clinical manifestations. Currently, in the state of Rio Grande do Sul (RS), only the molecular study for the F508del mutation is performed. Therefore, it becomes necessary to search for molecular methods that allow the detection of other mutations. The main objective of this study was to implement a molecular methodology for the detection of 11 mutations (R1162X, G85E, R117H, 2789 + 5G> A, G542X, R334W, W1282X, R553X, 1717-1G> A, 3120-1G> A and G551D) in CFTR gene, using the Single-Nucleotide Primer Extension (SNaPshot), and apply the methodology in a population with CF suspicion (altered or borderline sweat test or with F508del mutation detected). The genetic material was extracted from whole blood of 34 patients with CF suspicion by salting-out technique. The allele frequencies of mutations found by SNaPshot assay were: G542X (5.9%), R334W (1.5%), W1282X (2.9%), 3120-1G>A (2.9%). The genotypes found, complementary to the information of F508del, were: 9 (26,5%) F508del/unknown, 2 (5.9%) G542X / F508del, 1 (2.9%) 3120-1G>A / F508del, 1 (2.9%) R334W / F508del, 1 (2.9%) G542X / G542X, 1 (2.9%) 3120-1G>A / unknown, 1 (2.9%) W1282X/F508del and 1 (2.9%) W1282X/ unknown. Additionally, was performed the detection of F508del mutation in patients with CF suspicion that came to death during the screening process, besides of the standardization of a technique for the extraction of DNA from dry blood fixed on filter paper S&S 903. Ninety-three patients with IRT greater than 70 ng / mL have been studied. The frequency of 2,15% of these patients presented F508del mutation in heterozygosis. Through the developed study it was possible to standardize a molecular detection method for 11 mutations in the CFTR gene that, once implanted in the routine of Newborn Screening Service Reference, will allow xvii better targeting of the treatment, genetic counseling, prognosis and quality of patients life

Fibrose cística : nova abordagem de diagnóstico molecular e estudos in silico dos mecanismos moleculares da doença

A fibrose cística (FC) é uma doença genética autossômica recessiva com grande espectro de variabilidade clínica e mais de 2.000 variantes descritas. Afeta células epiteliais de diversos órgãos como pulmões, intestino, pâncreas, fígado, sistema reprodutivo e glândulas sudoríparas exócrinas. Este distúrbio é causado pelo funcionamento anormal da proteína Regulador da Condutância Transmembrana da Fibrose Cística (CFTR). Abordagens multifatoriais vêm aumentando a sobrevida de pacientes com FC, e nos recentes anos, o desenvolvimento de modernos medicamentos moduladores da CFTR tem realizado a transição da abordagem terapêutica profilática e sintomática para uma nova era da medicina de precisão, em que o medicamento visa a alteração básica da proteína CFTR de acordo com o genótipo do paciente, corrigindo a síntese, o tráfego ou a função da proteína que está sendo afetada. Com o tempo, estes fármacos tornam-se custo acessíveis, e para tornar viável a sua prescrição, além da aplicação de outras abordagens precisas conforme o genótipo do indivíduo, é fundamental que o paciente tenha o conhecimento da variante causadora da sua doença. Esta informação valiosa o acompanhará ao longo de sua vida, melhorando seu prognóstico. Em complemento, é necessário identificar e estudar as variantes e seus mecanismos moleculares. Modelos in silico são ferramentas úteis para prever o grau de patogenicidade de variantes incertas, auxiliando a elucidar a alteração da proteína a nível estrutural. Além disso, ferramentas de biologia de sistemas são essenciais para compreensão dos impactos das variantes em nível sistêmico. Três estudos foram realizados visando contribuir nesta temática. Em um primeiro estudo, objetivou-se padronizar um método custo- efetivo de extensão de base única para ampliação da cobertura de detecção do sistema de saúde pública do estado do Rio Grande do Sul, das atuais 12 para 37 variantes no gene CFTR. Em um segundo estudo, identificou-se uma nova variante causadora de defeito no gene CFTR, e previu-se sua patogenicidade empregando análise computacional. Por último, uma análise in silico, por biologia de sistemas, avaliou o perfil da expressão gênica em tecido brônquico e retal de indivíduos com FC (p.Phe508del homozigoto) e indivíduos controle. Os resultados do método de extensão de base única foram a ampliação da cobertura no diagnóstico molecular, com detecção de 93,01% dos alelos mutados conhecidos para FC na população brasileira. A nova variante encontrada (S511Lfs*2) é do tipo frameshift, e de acordo com o modelo in silico, de alta patogenicidade, associada a nenhuma síntese da proteína CFTR. Por fim, os estudos de biologia de sistemas nos epitélios brônquico e retal evidenciaram mecanismos que conduzem ao fenótipo da doença, por ontologias em comum entre os dois tecidos, mas também ontologias específicas. Todos estes estudos visam contribuir para uma melhor abordagem terapêutica, melhor qualidade de vida e um melhor prognóstico dos pacientes fibrocísticos.Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive genetic disease with a wide spectrum of clinical variation and more than 2,000 different variants. It affects epithelial cells of several organs such as lungs, intestines, pancreas, liver, reproductive system and exocrine sweat glands. This disorder is characterized by the abnormal functioning of the Cystic Fibrosis Conductance Transmembrane Regulator (CFTR) protein. Multifactorial approaches have increased the longevity of CF patients, and in recent years, the development of modern CFTR-modulating drugs has made a transition from the prophylactic and symptomatic therapeutic approach to a new era of precision medicine, in which the drug targets the base CFTR defect according to the patient's genotype, correcting the synthesis, traffic or function of the protein being affected. Over time, these drugs become cost-affordable, and to make their prescription viable, in addition to other precise approaches depending on the individual's genotype, it is essential that the patients know the variants that they have. This valuable information will accompany them throughout their life, improving their prognosis. In addition, it is necessary to identify and study variants and its molecular mechanisms. In silico models are useful tools to predict the degree of pathogenicity of uncertain variants, helping to elucidate the protein alteration at a structural level. In addition, systems biology tools are essential for understanding the impacts of variants at the system level. Three studies were carried out to cover up these themes. In a first study, the aim was to standardize a cost- effective minisequencing method to expand the detection coverage of the public health system in the state of Rio Grande do Sul, from the current 12 to 37 variants of the CFTR gene. In a second study, a new variant causing a defect in the CFTR gene was identified, and its pathogenicity was predicted using computational analysis. Lastly, an in silico analysis, by systems biology, evaluated the gene expression profile in bronchial and rectal tissues of FC individuals (p.Phe508del homozygous) and control individuals. The results of the minisequencing method were the expansion of the molecular diagnosis coverage, with detection of 93.01% of the known mutated alleles for CF in the Brazilian population. The new variant found (S511Lfs*2) is a frameshift type, and according to the in silico model, of high pathogenicity, associated with no CFTR protein synthesis. Finally, systems biology studies in the bronchial and rectal epithelia evidenced mechanisms that lead to the disease phenotype, through common ontologies between the two tissues, but also specific ontologies. All these studies aim to contribute to a better therapeutic approach, a better quality of life and a better prognosis for fibrocystic patients

Detecção de mutações no gene CFTR em pacientes com suspeitas de fibrose cística

A fibrose cística (FC) é uma doença genética autossômica recessiva de alta incidência em populações euro-descendentes (1: 2500 nascimentos) causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Aproximadamente 2.000 mutações foram descritas, sendo a mais prevalente F508del. Estas mutações causam disfunções na proteína CFTR que regula as passagens de cloro e de sódio através da membrana celular, conduzindo a diferentes graus de manifestações clínicas. Atualmente, no Rio Grande do Sul (RS), apenas o estudo molecular para a mutação F508del é realizada. Portanto, é necessário a busca por métodos moleculares que possibilitem a detecção de outras mutações. O objetivo principal desse estudo foi implementar uma metodologia molecular para a detecção de 11 mutações (R1162X, G85E, R117H, 2789 + 5G> A, G542X, R334W, W1282X, R553X, 1717-1G>A, 3120-1G>A e G551D) no gene CFTR, utilizando a extensão de base única (SNaPshot), e aplicá-la em uma população com suspeita de FC (teste do suor alterado ou limítrofe ou com a mutação F508del detectada). O material genético foi extraído a partir de sangue total de 34 pacientes com suspeita de FC através da técnica de salting-out. As frequências alélicas das mutações encontradas por SNaPshot foram: G542X (5,9%), R334W (1,5%), W1282X (2,9%), 3120-1G>A (2,9%). Os genótipos encontrados, levando em consideração o complemento de informações de F508del foram: 9 (26,5%) F508del/desconhecido, 2 (5,9%) G542X / F508del, 1 (2,9%) 3120-1G>A / F508del, 1 (2,9%) R334W / F508del, 1 (2,9%) G542X / G542X, 1 (2,9%) 3120-1G>A /desconhecido, 1 (2,9%) W1282X/F508del e 1 (2,9%) W1282X/desconhecido. Adicionalmente, foi realizada a detecção da mutação F508del em pacientes com suspeita de FC que vieram a óbito durante a triagem, além da padronização de uma técnica para extração de DNA a partir de sangue seco em papel filtro S&S 903. Noventa e três pacientes com IRT maior do que 70 ng/mL foram estudados. A frequência de 2,15% destes pacientes apresentou a mutação F508del em heterozigose. Através do estudo desenvolvido foi possível padronizar um método de detecção molecular de 11 mutações no gene CFTR que, uma vez implantado na rotina do Serviço de Referência de Triagem Neonatal, permitirá um melhor direcionamento do tratamento, aconselhamento genético, prognóstico e qualidade de vida dos pacientes.Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive genetic disease of high incidence in euro-descendant populations (1: 2500 live births) and is caused by mutations in the CFTR gene (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Approximately 2,000 mutations have been identified, F508del being the most prevalent. These mutations cause dysfunctions in the CFTR protein that regulates the passages of chloride and sodium across cell membranes, leading to different degrees of clinical manifestations. Currently, in the state of Rio Grande do Sul (RS), only the molecular study for the F508del mutation is performed. Therefore, it becomes necessary to search for molecular methods that allow the detection of other mutations. The main objective of this study was to implement a molecular methodology for the detection of 11 mutations (R1162X, G85E, R117H, 2789 + 5G> A, G542X, R334W, W1282X, R553X, 1717-1G> A, 3120-1G> A and G551D) in CFTR gene, using the Single-Nucleotide Primer Extension (SNaPshot), and apply the methodology in a population with CF suspicion (altered or borderline sweat test or with F508del mutation detected). The genetic material was extracted from whole blood of 34 patients with CF suspicion by salting-out technique. The allele frequencies of mutations found by SNaPshot assay were: G542X (5.9%), R334W (1.5%), W1282X (2.9%), 3120-1G>A (2.9%). The genotypes found, complementary to the information of F508del, were: 9 (26,5%) F508del/unknown, 2 (5.9%) G542X / F508del, 1 (2.9%) 3120-1G>A / F508del, 1 (2.9%) R334W / F508del, 1 (2.9%) G542X / G542X, 1 (2.9%) 3120-1G>A / unknown, 1 (2.9%) W1282X/F508del and 1 (2.9%) W1282X/ unknown. Additionally, was performed the detection of F508del mutation in patients with CF suspicion that came to death during the screening process, besides of the standardization of a technique for the extraction of DNA from dry blood fixed on filter paper S&S 903. Ninety-three patients with IRT greater than 70 ng / mL have been studied. The frequency of 2,15% of these patients presented F508del mutation in heterozygosis. Through the developed study it was possible to standardize a molecular detection method for 11 mutations in the CFTR gene that, once implanted in the routine of Newborn Screening Service Reference, will allow xvii better targeting of the treatment, genetic counseling, prognosis and quality of patients life

Characterization of Mutations Causing CYP21A2 Deficiency in Brazilian and Portuguese Populations

Deficiency of 21-hydroxylase enzyme (CYP21A2) represents 90% of cases in congenital adrenal hyperplasia (CAH), an autosomal recessive disease caused by defects in cortisol biosynthesis. Computational prediction and functional studies are often the only way to classify variants to understand the links to disease-causing effects. Here we investigated the pathogenicity of uncharacterized variants in the CYP21A2 gene reported in Brazilian and Portuguese populations. Physicochemical alterations, residue conservation, and effect on protein structure were accessed by computational analysis. The enzymatic performance was obtained by functional assay with the wild-type and mutant CYP21A2 proteins expressed in HEK293 cells. Computational analysis showed that p.W202R, p.E352V, and p.R484L have severely impaired the protein structure, while p.P35L, p.L199P, and p.P433L have moderate effects. The p.W202R, p.E352V, p.P433L, and p.R484L variants showed residual 21OH activity consistent with the simple virilizing phenotype. The p.P35L and p.L199P variants showed partial 21OH efficiency associated with the non-classical phenotype. Additionally, p.W202R, p.E352V, and p.R484L also modified the protein expression level. We have determined how the selected CYP21A2 gene mutations affect the 21OH activity through structural and activity alteration contributing to the future diagnosis and management of CYP21A2 deficiency