Análise de fluxos metabólicos com substrato isotopicamente marcado (13C-MFA) em S. typhimurium

Linhagens atenuadas de Salmonella têm sido estudadas para produção e veiculação de substâncias com fins terapêuticos. Modelos metabólicos à escala genômica são ferramentas importantes no desenvolvimento de estratégias de engenharia metabólica. Este trabalho teve por objetivo obter dados experimentais para aprimorar o modelo metabólico e aprofundar o conhecimento do metabolismo de S. typhimurium (St). Foram realizados cultivos contínuos à taxa de diluição (D) de 0,24 e 0,48 h-1, utilizando U-13C-glicose como substrato. Aminoácidos da biomassa foram analisados por GC-MS. A análise de fluxos metabólicos permitiu determinar a distribuição de fluxos nas principais vias metabólicas de St. A glicólise foi a via majoritamente utilizada para catabolisar a glicose. As maiores diferenças nos fluxos estimados, para as duas D, verificaram-se nas vias anapleróticas. Sobrepondo os dados de fluxos intracelulares ao modelo metabólico será gerado um modelo mais preciso do metabolismo de S. typhimurium

Avaliação de meios de cultura para produção de células de Salmonella typhimurium: Evaluation of culture media for the production of salmonella Typhimurium cells

A bactéria Salmonella typhimurium tem sido estudada para o desenvolvimento de vacinas contra diferentes agentes patogênicos com resultados bastante promissores. No entanto, apesar do uso frequente de S. typhimurium nestas pesquisas, pouco se sabe sobre as condições ótimas para o cultivo destas células em regime de alta densidade, o que é necessário para viabilizar a produção destas vacinas em larga escala. Neste trabalho foi feito o estudo da cinética de crescimento de S. typhimuium em 12 formulações de meio de cultivo, com o objetivo de encontrar a melhor composição que permitisse combinar alto acúmulo de biomassa e baixa produção de acetato. Foram   realizados quatro conjuntos de experimentos, em duplicata, combinando três fontes de carbono (glicose, glicerol e xilose) com quatro fontes de nitrogênio complexas (triptona, extrato de levedura, soytone e phytone). Os cultivos foram realizados em frascos agitados a 250 rpm e 37C, e as amostras coletadas foram analisadas por turbidimetria e HPLC. Entre as fontes de carbono, a glicose permitiu atingir os maiores valores de µmax, porém levou à formação de concentrações inibitórias de acetato. As fontes de nitrogênio de origem vegetal (soytone e phytone) combinadas  com xilose ou glicerol favoreceram um crescimento balanceado das células, com menor acúmulo de acetato e maior formação de biomassa. Em comparação com a condição controle (glicose + triptona), a formulação contendo o phytone combinado ao glicerol apresentou os melhores resultados, com um ganho de 40 % na produção de biomassa e redução de 45 % no acúmulo de acetato

Metabolic profiling of secreted fermentative byproducts by Salmonella typhimurium

Salmonella typhimurium is a pathogenic bacterium that has been studied to be used as a platform for vaccine development as a live bacterial vector (LBV). It is closely related to other enterobacteria like E. coli, but presents some metabolic differences regarding the efficiency of biomass and energy production. This work presents a metabolic profile of the main byproducts excreted by S. typhimurium aiming to evaluate the distribution of carbon between respiratory and fermentative pathways for this bacterium. A genome scale metabolic model (GSMM) of S. typhimurium was also used to simulate the phenotypic behavior of this bacterium under the studied conditions and compare the experimental results to the model predictions. Simulations were performed using the free software Optflux and biomass maximization was used as the objective function for Flux Balance Analysis (FBA). Experimental cultivations were conducted in 2 L bioreactors with a working volume of 0.8 L under varying dilution rates (D) of 0.1, 0.24, 0.5, 0.58 and 0.67 h-1, using 10.0 g/L of glucose as the sole carbon source and M9 minimum medium. The dissolved oxygen concentration was kept at 30 % of its saturation, and pH and temperature were kept constant at 7.0 and 37°C, respectively. Supernatant samples were analyzed by HPLC to measure glucose consumption rate and fermentative products formation. Our initial results showed an intense production of organic acids by S. typhimurium, mainly acetic acid, at increasing amounts for higher dilution rates, and starting from the lower dilution rate studied. From D of 0.5 to D = 0.67 h-1 formate was also produced, and the secretion rates of both by-products increased linearly with the growth rate. These results may reflect some metabolic limitations of the species under investigation concerning its respiratory capacity, as the fermentative pathways seem to be active even under low growth rates and aerobic conditions, what is not observed for E. coli. It is also noteworthy that a considerable fraction of the carbon consumed is directed to the formation of these metabolites, compromising the biomass formation. Simulation results employing the free software Optflux 3.0.7 and the GSMM STM_v1.0 predicted some aspects of the fermentative behavior observed in the experiments, but with low accuracy, indicating that the model employed (that was constructed based on an E. coli model) does not reflect the differences between the metabolism of these two closed related bacteria. Results from this work will be incorporated in the model to increase its predictive capacity regarding the organic acids formation by Salmonella cells

Otimização da produção de xilitol a partir de xilose por Candida parapsilosis atraves de analise por superficie de resposta

Orientador: Francisco Maugeri FilhoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Após testes com 18 leveduras diferentes, foi selecionada a espécie Candida parapsilosis IZ 1710. Cada ensaio de fermentação foi iniciado cultivando-se o inóculo por 24 h, a 30 °C e 250 rpm, em frascos de 500 ml com 100 ml de meio de crescimento, contendo glicose e xilose como fontes de carbono. As células cultivadas foram separadas por centrifugação e transferidas para frascos de 1000 ml com 200 ml de meio de fermentação contendo xilose como fonte de carbono e energia, extrato de levedura como nutriente orgânico e acetato de amônio como fonte de nitrogênio. Foram realizados 29 ensaios de fermentação sob diversas combinações de condições de temperatura, pH inicial do meio, concentração inicial de substrato e velocidade de agitação externa (variáveis independentes), previamente determinadas segundo o método de planejamento experimental por análise de superfície de resposta. O rendimento e a produtividade em xilitol foram escolhidos como as respostas (variáveis dependentes) a serem otimizadas. Os resultados obtidos nos 29 ensaios, juntamente com as condições experimentais correspondentes, foram submetidos a uma modelagem empírica, obtendo-se modelos de 2º ordem com elevado grau de ajuste aos pontos experimentais. Foram então construídas as figuras correspondentes às superfícies de resposta e linhas de contorno, para representar a variação das respostas em função das variáveis, possibilitando a determinação das condições ótimas para maximizar as respostas. Assim, 0,818 g de xilitol/g de xilose consumida foi determinado como o valor máximo previsto para o rendimento, nas seguintes condições ótimas: temperatura de 29,2 °C; pH inicial do meio igual a 4,4; concentração inicial de xilose de 144 g/l e velocidade de rotação de 119 rpm. Já para a produtividade em xilitol, foi previsto um valor máximo de 0,828 g/lh em condições ótimas ligeiramente diferentes, sendo: temperatura de 32,5 °C; pH inicial do meio igual a 6,4; concentração inicial de xilose de 144 g/l e velocidade de rotação de 162 rpm. Os resultados experimentais e previstos obtidos são da mesma ordem de grandeza que os melhores encontrados na literatura, indicando que a aplicação do método de planejamento proposto inicialmente foi bem sucedida, no sentido de identificar as condições fermentativas que favorecem a produção de xilitolAbstract: After running tests using 18 different yeasts, Candida parapsilosis IZ 1710 was selected for this study. Each fermentation run was started by growing selected yeast cells for 24 hs at 30 °C and 250 rpm in a 500 ml flask with 100 ml of growth media, containing xylose and glucose as carbon sources. The cultivated cells were harvested by centrifugation and transferred to a 1000 ml flask containing 200 ml of the fermentation media. The main components of fermentation media were xylose as a carbon source and ammonium acetate as a nitrogen source. Yeast extract was also added as a nutrient complement. Twenty nine fermentation runs were carried out under several combinations of temperature, pH, initial substrate concentration and agitation speed conditions (independent variables) previously determined according to the response surface method for experimental design. Xylitol yield and productivity (dependent variables) were chosen as the responses to be improved. The results obtained and experimental conditions used to perform 29 runs were submitted to empirical modelling. The second degree polynomials calculated showed an elevated level of fit to the experimental points. The corresponding response surface and contour levels plots for each response were drawn and the optima conditions to maximize the values of yield and productivity were determined. A maximum yield of 0.818 g of xylitol/g of consumed xylose was estimated for the following conditions: temperature of 29.2 °C, initial pH of 4.4, initial xylose concentration of 144 g/l and 119 rpm of agitation speed. Analogously, 0.828 g of xylitol/lh was the maximum estimated productivity under slightly different conditions, temperature of 32.5 °C, initial pH of 6.4, initial xylose concentration of 144 g/1 and 162 rpm for agitation speed. The estimated and experimental results are similar or even better than most of reported results, showing that the application of response surface method proposed initially was quite succesfull in identifying fermentations conditions that favour xylitol production by the selected microorganismMestradoMestre em Engenharia de Alimento