Effect of the Vitrification of Human Oocytes on the Binding Capacity and Acrosome Status of Human Sperm

Conocer los aspectos moleculares que acontecen en el proceso de unión de los espermatozoides humanos a la zona pelúcida (ZP) humana es uno de los grandes retos de la biología de la Reproducción. Por otra parte conocer si el proceso de fecundación puede verse afectado por la criopreservación de los gametos femeninos sigue siendo otra cuestión debatida en la literatura. En base a esto, el objetivo principal de este trabajo fue conocer si la vitrificación ovocitaria puede alterar la interacción de los espermatozoides con el glicocáliz de la ZP y demostrar si la ZP de estos ovocitos pierde la capacidad de inducir la reacción acrosómica en los espermatozoides. Según nuestros resultados el método de vitrificación ovocitaria cerrado (S3) no altera la capacidad de unión de los espermatozoides a la zona pelúcida, ni la capacidad de ésta para inducir la reacción acrosómica.To know the molecular aspects that occur in the process of human sperm binding to the human zona pellucida (ZP) is one of the great challenges of reproduction biology. Moreover knowing if the fertilization process may be affected by cryopreservation of female gametes is still another issue discussed in the literature. Based on this, the main objective of this study was to determine whether the oocyte vitrification may alter the interaction of sperm with the glycocalyx of ZP and show whether these oocytes lost the ability to induce the acrosome reaction in sperm. According to our results the oocyte closed vitrification method (S3) does not alter the ability of the sperm binding to the zona pellucida, and their ability to induce the acrosome reaction.Este trabajo fue subvencionado por el Vicerrectorado de Investigación de la Universidad de Alicante (VIGROB-137)

Metabolites involved in cellular communication among human cumulus-oocyte-complex and sperm during in vitro fertilization

Background: Fertilization is a key physiological process for the preservation of the species. Consequently, different mechanisms affecting the sperm and the oocyte have been developed to ensure a successful fertilization. Thus, sperm acrosome reaction is necessary for the egg coat penetration and sperm-oolema fusion. Several molecules are able to induce the sperm acrosome reaction; however, this process should be produced coordinately in time and in the space to allow the success of fertilization between gametes. The goal of this study was to analyze the metabolites secreted by cumulus-oocyte-complex (COC) to find out new components that could contribute to the induction of the human sperm acrosome reaction and other physiological processes at the time of gamete interaction and fertilization. Methods: For the metabolomic analysis, eighteen aliquots of medium were used in each group, containing: a) only COC before insemination and after 3 h of incubation; b) COC and capacitated spermatozoa after insemination and incubated for 16–20 hours; c) only capacitated sperm after 16–20 h in culture and d) only fertilization medium as control. Six patients undergoing assisted reproduction whose male partners provided normozoospermic samples were included in the study. Seventy-two COC were inseminated. Results: The metabolites identified were monoacylglycerol (MAG), lysophosphatidylcholine (LPC) and phytosphingosine (PHS). Analysis by PCR and in silico of the gene expression strongly suggests that the cumulus cells contribute to the formation of the PHS and LPC. Conclusions: LPC and PHS are secreted by cumulus cells during in vitro fertilization and they could be involved in the induction of human acrosome reaction (AR). The identification of new molecules with a paracrine effect on oocytes, cumulus cells and spermatozoa will provide a better understanding of gamete interaction.This study was supported by grant GV/2009/097 from Department of Education, Generalitat Valenciana, Vicerrectorado de Investigación, University of Alicante, Alicante, Spain (Vigrob-137), the Spanish Ministerio de Economía y Competitividad AGL2012-40180-C03-02 and Fundación Seneca (04542/GERM/06)

Reflexiones sobre el aprendizaje de la histología en biología y en ciencias de la salud

El conocimiento de la estructura, composición y función del organismo es fundamental en la formación de los graduados de Ciencias Biomédicas y de Ciencias de la Salud. Las células y los tejidos son los componentes básicos para comprender el normal funcionamiento del organismo y sus procesos patológicos. Por otra parte, la Histología es una de las disciplinas básicas con mayor cantidad de publicaciones sobre temas relacionados con su docencia. Sin embargo, a pesar de la abrumadora literatura existente, todavía no hay criterios claros sobre la pertinencia de los contenidos, los métodos en el aprendizaje y la evaluación de esta materia. En este trabajo; tras una revisión bibliográfica y a partir de la información aportada por profesores de Histología, se lo analizan las principales cuestiones que plantea el proceso de enseñanza aprendizaje de la Histología en el ámbito de Biomedicina (Biología, Medicina, Veterinaria, Enfermería, Nutrición, Fisioterapia, Biotecnología, etc.), a saber: su pertinencia, los contenidos a impartir, las estrategias y los medios didácticos a emplear y los métodos de evaluación. A partir de todos estos datos se describen los principales puntos fuertes y débiles de la Histología con las correspondientes sugerencias de cambio y adaptación al entorno actual

Capacitation and acrosome reaction changes α-tubulin immunodistribution in human spermatozoa

Tubulin is a protein constituent of cytoskeletal microtubules, closely related to sperm motility. However, the changes in tubulin distribution following capacitation and acrosome reaction are poorly understood. This study immunolocalized and quantified the expression of α-tubulin in fresh, capacitated and acrosome-reacted samples. Immunocytochemical data showed that in capacitated and acrosome-reacted spermatozoa, α-tubulin is labelled throughout most of the flagellum (⩾66.66%). However, the mean α-tubulin-labelled area in these samples was significantly lower than in fresh samples (P < 0.05). Thus, there are different sperm clusters distinguished by their α-tubulin immunoreactivity and this could be directly linked to structural changes following capacitation and acrosome reaction.This project was supported by the Cátedra de Medicina de la Reproducción, Alicante University-Instituto Bernabeu, Grant 4–12I to JDJ, as well as the Vicerrectorado de Innovación, University of Alicante, Spain, Grant Vigrob-137 to JDJ

New Approach for Chemometric Analysis of Mass Spectrometry Data

The search of metabolites which are present in biological samples and the comparison between different samples allow the construction of certain biochemical patterns. The mass spectrometry (MS) methodology applied to the analysis of biological samples makes it possible for the identification of many metabolites. Each obtained signal (m/z) is characteristic of a particular metabolite. However, the mass data (m/z) interpretation is difficult because of the large amount of information that they contain. In this work, we present a relatively simple tool that allows us to deal with the whole of the mass information from the chemometric analysis. The statistical analysis is a key stage in order to identify the metabolites involved in a particular biochemical pattern. We transformed the mass data matrix in a vector. By having the data as a vector, it was possible to keep all the information and also avoid the signals overlapping, which is the major problem when the total ion chromatogram (TIC) is obtained. In the approach proposed here, the mass data (m/z) matrix was split in 100 different TIC in order to avoid the signal overlapping. The 100 chromatograms were concatenated in a vector. This vector, which can be plotted as a continuous (2D pseudospectrum), greatly simplifies for one to understand the subsequent dimensional multivariate analysis. To validate the method, 19 samples from two human embryos culture medium were analyzed by high-pressure liquid chromatography–mass spectrometry (HPLC–MS). Our methodology would be applied to the obtained raw data. Later on, a multivariate analysis was conducted using a robust principal components analysis interval (robPCA) and interval partial least squares algorithm (iPLS). The results obtained allow one to differentiate the two sample populations undoubtedly, although their composition was similar.This work has been supported by grants from Instituto Bernabeu (Grant INSTITUTOBERNABEU1-08I) and the University of Alicante (Grant UAUSTI09-08) Project

Influence of the cryptozoospermia and obstructive azoospermia in embryo quality after intracytoplasmic sperm injection

Introducción: La azoospermia y la criptozoospermia son enfermedades relativamente comunes entre los varones, teniendo que recurrir a tratamientos de reproducción asistida (TRA) si desean tener descendencia. En este trabajo se valoró el comportamiento cinético y la morfología embrionaria en los primeros días de desarrollo en función de si la muestra seminal empleada era normal o procedente de varones azoospérmicos y criptozoospérmicos. Material y métodos: Se analizaron retrospectivamente 396 TRA, 40 procedentes de varones criptozoospérmicos, 17 de varones con azoospermia obstructiva y, el resto, de normozoospérmicos (según los criterios de la OMS, 2010). Las pacientes presentaron una respuesta ovárica normal y, para evitar el efecto de la edad materna, se incluyeron solo menores de 38 años. En todos los casos los ovocitos fueron fecundados mediante microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y la calidad embrionaria establecida según los criterios de ASEBIR (The Istanbul consensus workshop on embryo assessment, 2011). Resultados: La tasa de fecundación fue inferior cuando empleamos espermatozoides testiculares (aunque no significativa) y no hubo diferencias con espermatozoides de varones criptozoospérmicos. No se observaron variaciones significativas en la velocidad de división embrionaria. Respecto a la calidad embrionaria en el día 2, encontramos resultados comparables entre varones azoospérmicos y normozoospérmicos, mientras que esta disminuyó en el grupo de criptozoospérmicos (mayor porcentaje de embriones tipo C). Sin embargo, los resultados encontrados en el día 3 fueron similares entre los distintos grupos. Respecto a los datos clínicos, no se encontraron diferencias significativas en cuanto a las tasas de embarazo clínico y aborto del primer trimestre. Discusión: El empleo de muestras seminales criptozoospérmicas, afectó a la calidad embrionaria tras ICSI. Por el contrario, los resultados fueron comparables entre los grupos de varones normozoospérmicos y con azoospermia obstructiva.Introduction: Azoospermia and cryptozoospermia are relatively common diseases among men, who may have to resort to assisted reproduction if they wish to have children. In this work, an assessment is made of the kinetic behavior and morphology in the early days of embryo development as regards whether the semen sample is normal, azoospermic or cryptozoospermic. Material and methods: A retrospective analysis was performed on 396 treatments, which included 40 cryptozoospermic males, 17 obstructive azoospermic males, and the remainder normozoospermic (according to the criteria of the WHO, 2010). Patients had normal ovarian response and to avoid the effect of maternal age, only women under 38 years old were included. In all cases, the oocytes were fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and embryo quality as defined by the ASEBIR criteria (The Istanbul consensus workshop on embryo assessment, 2011). Results: Fertilization rate was lower when testicular sperm was used (although not significant) and there were no differences in cryptozoospermic males. No significant changes were observed in the rate of embryo cleavage. As regards embryo quality in day 2, results are comparable between normozoospermic and azoospermic group, while it decreased in the cryptozoospermic group (the percentage of embryos type C was higher). However, the results found in day 3 were similar between groups. Clinically, there were no significant differences in pregnancy rates or miscarriage. Discussion: The use of cryptozoospermic seminal samples affects the embryo quality after ICSI. On the other hand, the results were comparable between the groups of normozoospermic males and obstructive azoospermia

Study of structural damage after sperm immobilisation prior to intracytoplasmic sperm injection in teratozoospermic males

Objetivo: Describir y comparar las alteraciones ultraestructurales que puede provocar la inmovilización espermática previa a la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides, así como los daños en el ADN y el estado del acrosoma en espermatozoides de sujetos teratozoospérmicos y normozoospérmicos. Material y métodos: Se utilizaron 15 muestras seminales procedentes de donantes normozoospérmicos y 20 muestras de pacientes teratozoospérmicos del Instituto Bernabeu de Alicante. Para el estudio con microscopia electrónica de transmisión se utilizaron ovocitos humanos como receptáculo de los espermatozoides. La fragmentación del ADN se valoró mediante la técnica TUNEL, y el estado del acrosoma, utilizando la lectina Pisum sativum conjugada con FITC. El análisis estadístico entre los diferentes grupos se realizó mediante un test ANOVA. Resultados: Los resultados mostraron que, tras la inmovilización, los espermatozoides procedentes tanto de sujetos normozoospérmicos como de teratozoospérmicos sufrieron las mismas alteraciones ultraestructurales a nivel de la membrana plasmática y acrosomal. Tras valorar la fragmentación de ADN mediante TUNEL observamos que en los espermatozoides inmovilizados el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado era similar en ambos grupos (normozoospérmicos vs. teratozoospérmicos). En cambio, el porcentaje de espermatozoides con reacción acrosómica fue significativamente más elevado en los inmovilizados que en el grupo control, tanto en los sujetos normozoospérmicos como teratozoospérmicos. Conclusión: Los resultados de este estudio evidencian que los daños estructurales provocados por la inmovilización, en espermatozoides procedentes de sujetos normozoospérmicos y teratozoospérmicos, son independientes de la morfología espermática. Y además, dicho proceso no provoca fragmentación del ADN. Sin embargo, la inmovilización tanto en el grupo de los sujetos normozoospérmicos como teratozoospérmicos provoca una inducción mecánica de la reacción acrosómica.Objective: To describe and compare the ultrastructural alterations, DNA fragmentation and acrosome status that could cause sperm immobilisation prior to intracytoplasmic sperm injection, in samples from normozoospermic and teratozoospermic males. Material and methods: For this study we used 15 sperm samples from consenting normozoospermic donors and 20 samples from teratozoospermic males, submitted for assisted reproduction at Instituto Bernabeu of Alicante. To assess the ultrastructural alterations induced by immobilisation, human oocytes were used as containers for spermatozoa and then observed by transmission electron microscopy. DNA fragmentation was assessed using TUNEL and acrosome status using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin. The control group consisted of sperm without manipulation. Statistical analysis between groups was performed by ANOVA. Results: The results showed that immobilised spermatozoa presented the same damage in plasma and acrosomal membranes in the samples from both normozoospermic and teratozoospermic subjects. After assessing DNA fragmentation in the cells from normozoospermic and teratozoospermic patients by the TUNEL technique, we observed that the percentage of spermatozoa with DNA fragmentation did not increase in the immobilised group compared with the control group. However, the percentage of acrosome-reacted sperm was significantly greater in immobilised spermatozoa than in the control group in both normozoospermic and teratozoospermic males. Conclusion: The results of this study show that the structural damage caused by immobilisation in spermatozoa from teratozoospermic and normozoospermic males is independent of sperm morphology. In addition, the immobilisation does not cause DNA fragmentation. However, the percentage of acrosome-reacted sperm was greater in the immobilised group than in the control group, in both normozoospermic and teratozoospermic subjects.Este trabajo ha sido subvencionado por el proyecto de Investigación Emergente de la Universidad de Alicante (GRE08-P08) y el Vicerrectorado de Investigación de la Universidad de Alicante (VIGROB-137)

Biotecnología y biomedicina: sistema transversal de aprendizaje integrado de la ingeniería tisular

La clase invertida, más conocida por su nombre en inglés Flipped Classroom, es un modelo pedagógico en el que parte del proceso de enseñanza-aprendizaje se desarrolla fuera del aula, con el fin de aprovechar el tiempo en clase para trabajar en actividades que favorezcan un aprendizaje significativo. La asignatura Cultivos Celulares e Ingeniería Tisular se imparte, desde el curso académico 2013-2014, como asignatura optativa en el cuarto curso del grado en Biología. La experiencia que presentamos supone la preparación de un bloque de la asignatura en forma de clase invertida. Para ello se realizaron una serie de vídeos con los contenidos de dicho bloque, compuesto por 5 temas. Por su parte, durante las sesiones presenciales, el alumnado organizado en grupos de trabajo participa en el desarrollo de una web colaborativa o WiKi, contando con el apoyo del profesorado. A fin de evaluar el impacto de esta metodología se comparan los resultados obtenidos en este bloque por los alumnos que reciben esta metodología frente a los que recibieron clases magistrales tradicionales. Como conclusión mostramos que el uso de la clase invertida, asociado al trabajo colaborativo en clase, mejora el rendimiento académico de los estudiantes de Cultivos Celulares e Ingeniería Tisular

Biotecnología y biomedicina: sistema transversal de aprendizaje integrado de la ingeniería tisular

La clase invertida, más conocida por su nombre en inglés Flipped Classroom, es un modelo pedagógico en el que parte del proceso de enseñanza-aprendizaje se desarrolla fuera del aula, con el fin de aprovechar el tiempo en clase para trabajar en actividades que favorezcan un aprendizaje significativo. La asignatura Cultivos Celulares e Ingeniería Tisular se imparte, desde el curso académico 2013-2014, como asignatura optativa en el cuarto curso del grado en Biología. La experiencia que presentamos supone la preparación de un bloque de la asignatura en forma de clase invertida. Para ello se realizaron una serie de vídeos con los contenidos de dicho bloque, compuesto por 5 temas. Por su parte, durante las sesiones presenciales, el alumnado organizado en grupos de trabajo participa en el desarrollo de una web colaborativa o WiKi, contando con el apoyo del profesorado. A fin de evaluar el impacto de esta metodología se comparan los resultados obtenidos en este bloque por los alumnos que reciben esta metodología frente a los que recibieron clases magistrales tradicionales. Como conclusión mostramos que el uso de la clase invertida, asociado al trabajo colaborativo en clase, mejora el rendimiento académico de los estudiantes de Cultivos Celulares e Ingeniería Tisular