Purificación, clonación y expresión de inhibidores peptídicos de proteasas de potencial aplicación biomédica a partir de <i>Solanum tuberosum</i> spp.

Los inhibidores de proteasas de naturaleza proteica son importantes moléculas reguladoras que inhiben la acción de enzimas proteolíticas y se encuentran extensamente distribuidos en diferentes tejidos de animales, plantas y microorganismos. En su gran mayoría, los inhibidores de proteasas presentes en la naturaleza son proteicos, con la excepción de pequeños inhibidores de microorganismos. Estas moléculas han demostrado su acción en el tratamiento de diferentes patologías en las cuales la desregulación en la acción de las proteasas puede conducir a desequilibrios fisiológicos que llevan a la muerte celular. El presente trabajo de tesis doctoral tiene como objetivo el estudio de nuevas miniproteínas inhibidoras de carboxipeptidasas de tipo “cystine knot” a partir de extractos de tubérculos de Solanum tuberosum grupo andígenum variedada Churqueña. Para este propósito se aplicaron una diversidad de técnicas tales como la espectrometría de masas, biología molecular, expresión recombinante de proteínas, ensayos enzimáticos y caracterización del plegamiento oxidativo. Dentro de estas técnicas, la espectrometría de masas ha sido de gran importancia en este trabajo la cual fue de utilidad en la identificación, caracterización y validación de las moléculas estudiadas. El trabajo se encuentra dividido en tres capítulos a través de los cuales se presentan los resultados obtenidos. En el primer capítulo se describe el estudio y caracterización de un extracto crudo de tubérculos de papa andina determinando su actividad inhibitoria frente a proteasas de diferente tipo mecanístico. Se estudió la estabilidad térmica de los inhibidores de carboxipeptidasas presentes en el extracto y se determinaron los pesos moleculares de las proteínas resistentes a este tratamiento térmico mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Además, se utilizó una técnica proteómica, denominada Intensity Fading MALDI-TOF, mediante la cual se verificó la interacción de moléculas presentes en el extracto con carboxipeptidasa A. Por último, se purificó una molécula que produce inhibición de carboxipeptidasa A mediante cromatografía de afinidad y se realizó un análisis de la huella peptídica o PMF (Peptide Mass Fingerprinting) para su identificación de su secuencia primaria en bases de datos. En el segundo capítulo se presenta el estudio de dos miniproteínas con potencial actividad inhibitoria de carboxipeptidasas. Para llevarlo a cabo, ambas proteínas se expresaron de forma recombinante, se determinó su actividad inhibitoria y se realizaron estudios de plegamiento oxidativo. Además se presentan en este capítulo, modelos estructurales de una de las miniproteínas expresadas utilizando herramientas bioinformáticas. En el tercer capítulo, se aisló desde un brote de tubérculo de Churqueña el ARNm de un tercer inhibidor de carboxipeptidasa. En este capítulo, se muestran los resultados de la expresión recombinante y purificación de este inhibidor, y se presenta su actividad inhibitoria frente a carboxipeptidasas A y B. Asimismo, se describe la identificación de la proteína nativa en el extracto de papa mediante técnicas proteómicas como PMF-MALDI-TOF MS y secuenciación de novo PMF-MALDI-TOF-TOF/MS/MS.Facultad de Ciencias Exacta

Obtención de inhibidores peptídicos de proteasas a partir de extractos de Solanum tuberosum variedad andígena subvariedad churqueña

La regulación precisa de la actividad proteolítica es esencial para la fisiología humana, por esto la actividad de muchas proteasas se encuentra bajo estudio intensivo, ya que los inhibidores de proteasas (IP) son un tipo de regulador de las mismas. El empleo de productos vegetales para la cura de enfermedades tales como el cáncer, el SIDA y la malaria, entre otras, puede ser una de las claves terapéuticas a utilizarse en el futuro. La tecnología y la creación de instrumentos para una fina purificación es lo que nos permitirá detectar los componentes individuales que contienen las propiedades curativas, soportes de la industria farmacéutica y de la biomedicina. Con todo esto y aprovechando la disponibilidad de infraestructura y la experiencia adquirida por nuestro grupo de trabajo, se propone aislar y caracterizar un nuevo inhibidor de proteasas de origen vegetal a partir de tubérculos de papas andinas.Facultad de Ciencias Exacta

Obstáculos epistemológicos en matemática: una experiencia didáctica sobre lógica proposicional

La experiencia que presentamos surgió como propuesta de la materia humanística de posgrado de la (UNLP), “Fundamentos epistemológicos e históricos de la enseñanza de las ciencias'', materia obligatoria para la obtención del título de Doctor de la Facultad de Ciencias Exactas, dictada en el segundo semestre del año 2015. Los responsables de la materia fueron el Dr. Diego Petrucci, el Dr. Osvaldo Capannini y el Lic. Daniel Badagnani. El objetivo de nuestra experiencia fue detectar una situación particular que ocurre en los diferentes niveles educativos (en mayor o menor medida), que se conoce como obstáculo epistemológico y analizar en qué medida influye en la adquisición de conocimiento por parte de los estudiantes. Un obstáculo epistemológico es un conocimiento o una concepción generalizada en una comunidad o en una cultura, que habiendo producido respuestas apropiadas dentro de un cierto dominio, genera respuestas falsas fuera de él. En este trabajo analizamos el obstáculo del razonamiento común, esto es, la constitución del razonamiento utilizado en la interacción social diaria como obstáculo para el razonamiento lógico deductivo en Geometría.Eje 1: La enseñanza universitaria en el contexto actual: transformaciones y propuestas. Reflexiones y experiencias en la enseñanza de las Ciencias Exactas.Secretaría de Asuntos Académico

Identificación de inhibidores peptídicos de proteasas con potencial aplicación biomédica obtenidos a partir de <i>Solanum tuberosum</i> subespecie <i>andígena</i> variedad imillanegra (papa andina)

Introducción: Los inhibidores de proteasas (IPs) tienen importantes aplicaciones en la biomedicina, la biotecnología y el diagnóstico. Una regulación precisa de la actividad proteolítica es esencial para la fisiología humana, por esto muchas proteasas se han convertido en importantes dianas biomédicas, protagonizando casi la mitad de los fármacos del mundo para el tratamiento de patologías. Estudios con células cancerosas indicaron que algunos inhibidores actúan sobre diferentes proteasas serínicas que están implicadas en las cadenas de señalización de células tumorales, impidiendo su proliferación. Objetivos: El objetivo de este trabajo es el aislamiento, purificación e identificación de nuevos inhibidores de proteasas obtenidos a partir de tubérculos de Solanum tuberosum subespecie andígena variedad Imillanegra, provenientes de la región andina, para su potencial aplicación en el desarrollo de nuevos biofármacos. Materiales y Métodos: La combinación de la espectrometría de masas junto a la inmovilización de proteasas ha logrado desarrollar una técnica rápida y versátil “High-throughput screening” (HTS) que permite realizar un screening rápido para la identificación molecular. Esta metodología ha permitido identificar IPs en extractos heterogéneos que fueron posteriormente purificados y caracterizados por métodos convencionales. Resultados: Se encontraron nuevos inhibidores de tripsina y subtilisina (serinproteasas) que fueron caracterizados bioquímicamente. Conclusiones: Los procesos de purificación mediante inmovilización enzimática han sido claves para el aislamiento de inhibidores. Estas biomoléculas abren un camino potencial para el desarrollo de tratamientos adecuados para diversas enfermedades. Esto pudiera producir grandes avances diagnósticos y terapéuticos, lo que demuestra la importancia de estas tecnologías para la identificación y caracterización de nuevos IPs.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Biochemical characterization of the YBPCI miniprotein, the first carboxypeptidase inhibitor isolated from Yellow Bell Pepper (<i>Capsicum annuum</i> L) : A novel contribution to the knowledge of miniproteins stability

The cystine-knot metallocarboxypeptidase inhibitors (MCPIs) are peptides that contribute to control proteolytic activity, involved in storage, growth and maintenance of plants. Lately studies reported several MCPIs with potential use in biomedical applications; as anti-cancer, anti-thrombotic, anti-malaric and anti-angiogenic agents. We report the isolation, purification, chemical stability and biochemical characterization of a novel carboxypeptidase A inhibitor (YBPCI) isolated from Capsicum annuum L. var. Yellow Bell Pepper, the first cystine-knot miniprotein (CKM) of the species. We demonstrate the stability of YBPCI (IC50 = 0.90 μg/ml) to high temperatures, high salt concentration and extreme pH values. MALDI-TOF/MS analysis detected a molecular weight of 4057 Da, and peptide mass fingerprint resulted in no matches with other protease inhibitors. In vitro gastrointestinal digestion subjecting YBPCI to pH 2 incubation and proteolytic attack resulted in complete inhibitory activity. To summarize, there are no reports to date of carboxypeptidase inhibitors in C. annuum species, giving our report much more relevance.Facultad de Ciencias ExactasCentro de Investigación de Proteínas Vegetale

Efectos biológicos de inhibidores de proteasas en alimentos

Los productos naturales constituyen una de las mayores fuentes para el desarrollo de alimentos, debido a su diversidad química y a que se les supone una toxicidad inicial limitada al encontrarse en seres vivos. Entre estos productos se encuentran los inhibidores de proteasas (IPs). Las fuentes vegetales de IPs han sido escasamente exploradas y tienen la ventaja de su extraordinaria riqueza y diversidad. Tienen menor costo de obtención y procedimientos muy sencillos, si se comparan con los procedimientos de obtención por síntesis química. Seguramente el mayor incentivo para la búsqueda de nuevos IPs es que el control de la proteólisis de las proteasas propias del alimento o actividad antimicrobiana presente en el mismo representa una herramienta valiosa a la hora de conservar alimentos (Ayensa, 2002; Jin-Young et al., 2005). La combinación de la espectrometría de masas junto a la inmovilización de proteasas ha logrado desarrollar una técnica rápida y versátil “High-throughput screening” (HTS) que permite realizar un screening rápido para la identificación de moléculas. Esta metodología ha permitido identificar IPs en extractos heterogéneos que fueron posteriormente purificados y caracterizados por métodos convencionales. Por medio de IF/MALDI TOF/MS, se pudo identificar nuevos IPs obtenidos a partir de Solanum tuberosum subespecie andígena de la variedad Imillanegra (papa andina) utilizando para su purificación microcolumnas de tripsina inmovilizada en soportes de glioxil agarosa. Con todo esto se propone (aprovechando también nuestra experiencia en el estudio bioquímico y estructural de las proteínas, sus aplicaciones biotecnológicas y la infraestructura disponible en nuestro laboratorio) continuar con la detección, purificación, caracterización bioquímica y aplicación de técnicas bioinformáticas sobre nuevos inhibidores de proteasas que demuestren posibilidades de potenciales aplicaciones en el desarrollo de nuevas sustancias utilizadas en la conservación de alimentos.Facultad de Ciencias Exacta

Biochemical and MALDI-TOF Mass Spectrometric Characterization of a Novel Native and Recombinant Cystine Knot Miniprotein from <i>Solanum tuberosum</i> subsp. <i>andigenum</i> cv. Churqueña

Cystine-knot miniproteins (CKMPs) are an intriguing group of cysteine-rich molecules that combine the characteristics of proteins and peptides. Typically, CKMPs are fewer than 50 residues in length and share a characteristic knotted scaffold characterized by the presence of three intramolecular disulfide bonds that form the singular knotted structure. The knot scaffold confers on these proteins remarkable chemical, thermal, and proteolytic stability. Recently, CKMPs have emerged as a novel class of natural molecules with interesting pharmacological properties. In the present work, a novel cystine-knot metallocarboxypeptidase inhibitor (chuPCI) was isolated from tubers of Solanum tuberosum, subsp. andigenum cv. Churqueña. Our results demonstrated that chuPCI is a member of the A/B-type family of metallocarboxypeptidases inhibitors. chuPCI was expressed and characterized by a combination of biochemical and mass spectrometric techniques. Direct comparison of the MALDI-TOF mass spectra for the native and recombinant molecules allowed us to confirm the presence of four different forms of chuPCI in the tubers. The majority of such forms have a molecular weight of 4309 Da and contain a cyclized Gln in the N-terminus. The other three forms are derived from N-terminal and/or C-terminal proteolytic cleavages. Taken together, our results contribute to increase the current repertoire of natural CKMPs.Facultad de Ciencias Exacta

Nuevos inhibidores de proteasas con potencial utilización en la industria alimentaria obtenidos a partir de papa andina

En los últimos años, la biotecnología y sus aplicaciones industriales han experimentado grandes logros en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica. El empleo de productos vegetales para la conservación de alimentos es uno de los procesos que busca actualmente la “química verde” para tratar carnes, vegetales y productos envasados en general, para prolongar la vida útil del alimento. Dentro de estos productos bioactivos se encuentran los inhibidores de metalocarboxipeptidasas los cuales, entre otras acciones, inhiben el crecimiento bacteriano o fúngico. La regulación precisa de la actividad proteolítica es esencial para la fisiología de los microorganismos, como ser la producción de toxinas, entre otras, por esto la actividad de muchas proteasas se encuentra bajo estudio intensivo, ya que los inhibidores de proteasas (IP) son un tipo de regulador de las mismas. La tecnología y la creación de instrumentos para una fina purificación como la inmovilización de enzimas y la espectrometría de masas es lo que ha permitido detectar y caracterizar componentes individuales como los inhibidores de proteasas con posibles propiedades conservantes del alimento. Por otra parte, cabe destacar además que, en el caso de los inhibidores peptídicos de origen vegetal, son mínimos los estudios referidos al material botánico de la flora Argentina. Dada la gran biodiversidad vegetal existente en nuestro país resulta de sumo interés la implementación de una búsqueda de nuevas moléculas naturales capaces de modificar o modular la actividad biológica de proteasas y microorganismos que estén involucradas en la conservación de alimentos o en funciones nutricionales. En el presente trabajo se ha purificado y caracterizado un nuevo inhibidor de Carboxipeptidasa A de 4,3 KDa obtenido a partir de Solanum Tuberosum subespecie andigenum variedad Churqueña (Papa Andina). Los tratamientos térmicos del inhibidor muestran que conserva actividad luego de un proceso de 1 hora a 100°C.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Biochemical characterization of the YBPCI miniprotein, the first carboxypeptidase inhibitor isolated from Yellow Bell Pepper (<i>Capsicum annuum</i> L) : A novel contribution to the knowledge of miniproteins stability

The cystine-knot metallocarboxypeptidase inhibitors (MCPIs) are peptides that contribute to control proteolytic activity, involved in storage, growth and maintenance of plants. Lately studies reported several MCPIs with potential use in biomedical applications; as anti-cancer, anti-thrombotic, anti-malaric and anti-angiogenic agents. We report the isolation, purification, chemical stability and biochemical characterization of a novel carboxypeptidase A inhibitor (YBPCI) isolated from Capsicum annuum L. var. Yellow Bell Pepper, the first cystine-knot miniprotein (CKM) of the species. We demonstrate the stability of YBPCI (IC50 = 0.90 μg/ml) to high temperatures, high salt concentration and extreme pH values. MALDI-TOF/MS analysis detected a molecular weight of 4057 Da, and peptide mass fingerprint resulted in no matches with other protease inhibitors. In vitro gastrointestinal digestion subjecting YBPCI to pH 2 incubation and proteolytic attack resulted in complete inhibitory activity. To summarize, there are no reports to date of carboxypeptidase inhibitors in C. annuum species, giving our report much more relevance.Facultad de Ciencias ExactasCentro de Investigación de Proteínas Vegetale

Association between β2-adrenoceptor (ADRB2) haplotypes and insulin resistance in PCOS

OBJECTIVE: The aim of this study was to explore β2-adrenoceptor (ADRB2) haplotype associations with phenotypes and quantitative traits related to insulin resistance (IR) and the metabolic syndrome (MS) in a polycystic ovary syndrome (PCOS) population. A secondary purpose was to assess the association between ADRB2 haplotype and PCOS. DESIGN: Genetic polymorphism analysis. Cross-sectional case-control association study. SETTING: Medical University Hospital and research laboratory. PATIENTS: One hundred and sixty-five unrelated women with PCOS and 116 unrelated women without PCOS (control sample). MEASUREMENTS: Clinical and biochemical measurements, and ADRB2 genotyping in PCOS patients and control subjects. METHODS: ADRB2 haplotypes (comprising rs1042711, rs1801704, rs1042713 and rs1042714 in that order), genotyping and statistical analysis to evaluate associations with continuous variables and traits related to IR and MS in a PCOS population. Associations between ADRB2 haplotypes and PCOS were also assessed. RESULTS: We observed an age-adjusted association between ADRB2 haplotype CCGG and lower insulin (P = 0·018) and HOMA (P = 0·008) in the PCOS sample. Interestingly, the expected differences in surrogate measures of IR between cases and controls were not significant in CCGG/CCGG carriers. In the case-control study, genotype CCGG/CCGG was associated with a 14% decrease in PCOS risk (P = 0·043), taking into account confounding variables. CONCLUSIONS: Haplotype I (CCGG) has a protective role for IR and MS in PCOS.Fil: Tellechea, Mariana Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Genética y Biología Molecular; ArgentinaFil: Muzzio, Damián Oscar. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Genética y Biología Molecular; ArgentinaFil: Iglesias Molli, Andrea Elena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Genética y Biología Molecular; ArgentinaFil: Belli, Susana H.. Hospital Carlos Durand; ArgentinaFil: Graffigna, Mabel N.. Hospital Carlos Durand; ArgentinaFil: Levalle, Oscar A.. Hospital Carlos Durand; ArgentinaFil: Frechtel, Gustavo Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Genética y Biología Molecular; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Hospital de Clínicas General San Martín; ArgentinaFil: Cerrone, Gloria Edith. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Genética y Biología Molecular; Argentin