A successful strategy for the recovering of active P21, an insoluble recombinant protein of Trypanosoma cruzi

Structural studies of proteins normally require large quantities of pure material that can only be obtained through heterologous expression systems and recombinant technique. in these procedures, large amounts of expressed protein are often found in the insoluble fraction, making protein purification from the soluble fraction inefficient, laborious, and costly. Usually, protein refolding is avoided due to a lack of experimental assays that can validate correct folding and that can compare the conformational population to that of the soluble fraction. Herein, we propose a validation method using simple and rapid 1D H-1 nuclear magnetic resonance (NMR) spectra that can efficiently compare protein samples, including individual information of the environment of each proton in the structure.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)INBEQMeDIUniv Fed Uberlandia, Inst Ciencias Biomed, BR-38400 Uberlandia, MG, BrazilUniv São Paulo, Inst Fis Sao Carlos, Sao Carlos, SP, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Escola Paulista Med, Dept Microbiol Imunol & Parasitol, Vila Mariana, SP, BrazilUniv Fed Minas Gerais, Inst Ciencias Biol, Dept Biol Geral, Belo Horizonte, MG, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Escola Paulista Med, Dept Microbiol Imunol & Parasitol, Vila Mariana, SP, BrazilFAPESP: 2010/51867-6FAPESP: 2012/21153-7FAPEMIG: APQ-00621-11FAPEMIG: APQ-00305-12CAPES: 23038.005295/2011-40Web of Scienc

Physico-chemical and biochemical studies of a 21 kDa protein of Trypanosoma cruzi

A proteína P21 do Trypanosoma cruzi participa no processo de infecção da célula hospedeira, desse modo é de grande importância: elucidar as vias de sinalização induzidas pela proteína, bem como caracterizar a nível molecular e estrutural a P21. O que vai auxiliar no entendimento da função biológica da P21 e sua participação no processo de infecção. A P21 recombinante é expressa Escherichia coli em sua maioria na fração insolúvel. Visando aumento de proteína na fração solúvel, foi realizada a clonagem do gene da P21 em vetor pSMT3, bem como testes de expressão subsequentes em diferentes cepas de expressão de E. coli, em vetor pET-28 e pSMT3 e variadas condições de expressão e lise celular. Desse modo obtiveram-se as condições que permitissem uma maior concentração da P21 na fração solúvel. A expressão foi realizada no vetor pET-28, cepa BL21, a 37°C com meio 2xYT a 0.5 mM de IPTG, utilizando a técnica de sonicação como lise. A P21 foi purificada em cromatografia de afinidade e posteriormente em coluna de exclusão molecular. Foram realizados estudos de modelagem por homologia levaram a elaborar a hipótese de que a P21 tem a função de inibidor de serinoprotease do tipo kunitz. Posteriormente essa hipótese foi confirmada com ensaios de avaliação da atividade inibitória da P21 frente à tripsina, quimiotripsina e elastase neutrofílica, o qual a P21 mostrou capaz de inibir a elastase neutrofílica. Estudos com espalhamento dinâmico da luz (DLS) revelaram que as amostras testadas de P21 contém diferentes concentrações de agregados de alto peso molecular em todos os pHs avaliados. Outras medidas foram realizadas para avaliar o estado de agregação da P21 de acordo com a temperatura e verificou-se que entre 32-52 °C, a proteína apresenta menor raio hidrodinâmico, indicando menor agregação nesse intervalo. Estudos de dicroísmo circular revelaram que a P21 apresenta por volta de 20% de α hélice, 32% de folha-β, 22% de volta e 23 % estrutura randômica. De acordo com a curva de desnaturação referente ao espectro de CD obtido, a P21 se mostra desnaturada a partir de 64°C.The Trypanosoma cruzi protein P21 participates in the host cell infection process, but its specific function is poorly described. Thus it is important to elucidate the signaling pathways induced by the protein and characterize the P21 at the structural and molecular levels, as a contribution towards the understanding of the P21 biological function and its role in the infection process. The Escherichia coli recombinant P21 is expressed mostly in the insoluble fraction. Aiming to increase protein in the soluble fraction, we performed the cloning of the P21 gene in pSMT3 vector and subsequent expression tests in different expression strains of E. coli in pET-28 and pSMT3 vectors and varied expression conditions and cell lysis. Thus we obtained conditions that allow a greater concentration of the P21 in the soluble fraction. The expression vector was performed using vector pET-28, in Bl21 strain at 37°C in 2xYT culture medium with 0.5 mM IPTG, using the sonication technique in cell lysis. The recombinant P21 was purified by Ni affinity chromatography and subsequently a molecular exclusion column. We performed homology modeling studies which led to assume that P21 can be a serinprotease inhibitor of Kunitz type. Furthermore, this hypothesis was confirmed in the experiments testing the P21 inhibitory activity against the trypsin, chymotrypsin and elastase. We found the P21 exclusively inhibit neutrophil elastase. Studies using dynamic light scattering (DLS) revealed that the samples containing P21 contained large molecular weigth aggregates in different concentrations at all evaluated pHs. Others measurements were performed to assess the P21 aggregation state according to the temperature and we found that between 32-52 °C the protein had a smaller hydrodynamic radius, indicating less aggregation in this range. Circular dichroism (CD) studies revealed that P21 has about 20% α-helix, 32% β, -sheet, 22% turn and 23% of random structure. According to the denaturation curve for the CD spectrum obtained, the P21 was denatured from 64°C

Endocytosis and cell transport of pulchellin isoforms

A pulchellina é uma glicoproteína heterodimérica com duas cadeias, pertencente à família das proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) do tipo 2. A cadeia A é enzimaticamente ativa e é capaz de remover uma adenina da porção 28S do rRNA; a cadeia B é uma lectina que se liga a resíduos de D-Galactose terminais, presentes na membrana. Das 4 isoformas da pulchellina (PI, PII, PIII, PIV), PII é a mais tóxica in vivo, sendo a atividade catalítica da cadeia A similar para todas as isoformas. A interação da cadeia B com os glicoreceptores de membrana e seu conseguinte processo de endocitose é crucial para que cadeia A tóxica entre na célula e torne-se disponível para atuar no seu sítio ribossomal. Assim, visando explorar e encontrar potenciais diferenças no mecanismo de ligação à célula e de endocitose das isoformas, foram realizados experimentos usando microscopia confocal com as toxinas marcadas com Alexa flúor® em células HeLa e MV3. As imagens obtidas mostraram que PII localiza-se na região perinuclear das células enquanto PIV predomina na região cortical. Esses resultados sugeriram que as isoformas apresentam distintos mecanismos de entrada e transporte nas células. Para esclarecer tal questão, a ação da pulchellina em células HeLa tratadas com diversas drogas que atuam em diferentes rotas endocíticas e de translocação, foi monitorada. Os resultados de inibição de síntese proteica mostraram que as células sofrem proteção contra a pulchellina na presença de brefeldina A, indicando que a pulchellina necessita ser transportada via Golgi para executar sua função. Inibidores de glicosilação como tunicamicina, swainsonine e inibidores de síntese proteica, como a puromicina e cicloheximidina sensibilizaram as células à PII e PIV, mas em diferentes taxas. Por outro lado, a puromicina e a cicloheximidina não afetaram a taxa de endocitose das isoformas, o que indica que a pulchellina na ausência dos inibidores compete pelo transporte ou processamento de glicoproteínas recém-sintetizadas. Experimentos de ligação e captação da pulchellina mostraram que PII apresenta 30% menos afinidade pela superfície de células HeLa que PIV, além de apresentar menor taxa endocítica. Esses dados corroboram estudos de FCS (espectroscopia de correlação e fluorescência) que identificaram que a difusão de PIV em células HeLa é maior que de PII. Nos experimentos realizados com inibidores de dinamina, ambas isoformas tiveram as suas taxas de endocitose aumentadas, indicando um efeito compensatório para via endocítica independente de dinamina. Em células incubadas com PDMP e neuraminidase, PIV mostrou uma associação às células reduzida, enquanto PII não se alterou, indicando que PIV pode necessitar de esfingolipídeos e glicocomplexos contendo ácido siálico para ligar e se internalizar nas células testadas. Para investigar essa diferença na interação foram realizados ensaios in vitro de DSC (Calorimetria Diferencial de Varredura) e SPR (ressonância plasmônica de superfície) com as isoformas isoladas. Esses ensaios mostraram que PIV e PII apresentam interações distintas com o gangliosídeo GM1, sendo que a PIV interage mais hidrofobicamente e com uma maior taxa de associação com GM1 que a PII.Pulchellin is a heterodimeric toxin found in Abrus pulchellus seeds. It is a type 2 ribosome inactivating protein, which consists of a toxic A-chain linked to a sugar binding B-chain. The B-chain mediates its binding to the galactose residues on the cellular membrane in a process that is then followed by an endocytic uptake. Once the A-chain reaches the cytosol it inhibits protein synthesis leading to cell death. In order to explore pulchellin isoforms II and IV (PII and PIV) cell entry and transport mechanisms, experiments monitoring toxin labelled with Alexafuor® in MV3 and HeLa cells were performed using confocal microscopy. We have investigated the pulchellin action in pre-treated HeLa cells with several drugs, targeting different endocytic and translocation routes. Confocal images showed PII tends to be localized in cells cortical region and PIV tend to be localized in cell\'s perinuclear region, suggesting that isoforms have different cell entry and transport mechanisms. The protein synthesis inhibition results showed that brefeldin A protects cells against the toxic effect of pulchellin, which indicates the pulchellin needs to be transported to Golgi to perform its toxic effect. When HeLa cells were incubated with protein synthesis inhibitors, such as puromycin and cycloheximidine and glycosilation inhibitors such as tunicamycin, swainsonine, they were sensitized to pulchellin, but to different extent for PII and PIV. Binding and uptake experiments showed that PII exhibits 30% less affinity than PIV on HeLa cells surface, PII also has lower endocytic rate than PIV in the cells. These data corroborate with FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) results, which identified that PIV diffuses faster than PII into the celIs. Dynamine inhibitors increased endocytosis rates in both isoforms, indicating that pulchellin is upregulating the dynamine-independent endocytosis, possibly pulchellin is being internalized into the cells by alternative endocytic routes. When HeLa cells were incubated with PDMP and neuraminidase, PIV showed a reduced cell association compared with PII and control, indicating that PIV may require glycocomplexes and sphingolipids containing sialic acid to enter into the cells. DSC (Differential Scanning Calorimetry) and SPR (Surface Plasmon Ressonance) experiments using biomimetic membranes were performed using GM1 ganglioside to check this interaction. The results showed PIV and PII interact with GM1. This results also evidence PIV interact more hidrophobically and with a higher association rate on GM1 than PII