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Susceptibility of premeiotic male germ cells to malignant transformation
In der vorliegenden Arbeit wurde die SuszeptibilitĂ€t der Spermatogonien und Spermatozyten zur malignen Transformation ĂŒber einen experimentellen in vivo- und ĂŒber einen experimentellen in vitro Ansatz evaluiert. Ziel des in vivo Ansatzes war es zu untersuchen, ob transgene MĂ€use ĂŒber eine zielgerichtete und stadienspezifische Expression eines viralen Onkogens in den Spermatozyten bzw. Spermatogonien maligne transformiert werden können. Als virales Onkogen wurde das SV40 large T Antigen (LTA) verwendet. Die stadienspezifische Expression des LTA in den Spermatozyten erfolgte unter der Kontrolle des humanen Phosphoglycerat-Kinase 2 (PGK2)-Promotors. Die generierten PGK2-LTA transgenen MĂ€use zeigten eine testisspezifische Expression des large T Antigens ab dem postnatalen 12. Tag der testikulĂ€ren Entwicklung, also im Stadium der PrĂ€leptotĂ€nspermatozyten. Auch nach 20 Monaten zeigten die PGK2-LTA transgenen MĂ€use keine Tumorentwicklung im Testis oder in anderen Organen. PrĂ€pubertĂ€re PGK2-LTA transgene MĂ€use zeigten eine abnorme Keimzellproliferation, die sich in einer signifikanten und transienten Erhöhung der Anzahl an Spermatozyten manifestierte. In spĂ€teren Altersstadien assimilierte sich die erhöhte Anzahl der Spermatozyten in den transgenen MĂ€usen an die Anzahl in den WildtypmĂ€usen ĂŒber Apoptose. Die Analyse der PGK2-LTA transgenen MĂ€use demonstriert, dass Spermatozyten nicht die Potenz zur malignen Transformation aufweisen. Um das LTA stadienspezifisch in den Spermatogonien zu exprimieren, wurde der humane TSPY (testis-specific protein, Y-encoded)-Promotor als 5'-regulierende Sequenz verwendet. Insgesamt konnten zwei Linien (Linie 23 u. Linie 61) etabliert werden, die eine Expression von LTA im Testis aufweisen. Expressionsanalysen mit RNAs aus verschiedenen Geweben zeigten neben der Expression im Testis auch eine Expression in der Milz. Beim Founder 57 sowie bei mehreren Tieren in der Linie 23 traten im Alter von 3-4 Monaten Tumoren in der Sella turcica auf. Dabei handelt es sich vermutlich um Hypophysentumoren. GegenwĂ€rtig werden diese Tumoren auf die Expression spezifischer Markergene analysiert, um die genaue SpezifitĂ€t des Tumors zu determinieren. Die Analyse der TSPY-LTA transgenen MĂ€use ist zum gegenwĂ€rtigen Zeitpunkt noch nicht abgeschlossen. Ziel des in vitro Ansatzes war es mit Hilfe von immortalisierten Keimzellinien die Potenz der Spermatozyten und der Spermatogonien zur malignen Transformation zu evaluieren. Die immortalisierte Spermatogonienzellinie GC-1spg und die immortalisierte Spermatozytenzellinie GC-4spc sollten auf der Ebene des PhĂ€notyps sowie auf der Ebene der Expression miteinan-der verglichen werden. ZunĂ€chst wurde eine neue Spermatozytenzellinie GC-4spc der Maus unter Verwendung des Promotor-basierten Selektionsverfahrens hergestellt. Die etablierte GC-4spc Zellinie wĂ€chst adhĂ€rent und wurde bereits fĂŒr mehr als 30 Generationen kultiviert. AuĂerdem weist die Zelllinie einen diploiden DNA-Gehalt auf, womit ausgeschlossen ist, dass die Zellen in vitro weiter in haploide Spermatiden differenzieren. Die GC-4spc Zellinie wurde auf ihre StadienspezifitĂ€t evaluiert. Dabei konnte eine Expression des Pgk2-Gens, des Proakrosin-Gens und des A-myb-Gens nachgewiesen werden. Bei der Maus werden diese Gene keimzellspezifisch exprimiert, darĂŒber hinaus sind das Pgk2-Gen und das Proakrosin-Gen spezifische Expressionsmarker fĂŒr Spermatozyten. Ăberdies zeigte eine 1.4 kb lange 5'-flankierende Sequenz des humanen PGK2-Gens eine erhöhte transkriptionelle AktivitĂ€t in der GC-4spc Zellinie. Ex-pressionsanalysen von Markergenen fĂŒr andere Zelltypen im Testis wie Peritubular-Zellen, Sertoli-Zellen, Leydig-Zellen oder Makrophagen waren negativ. Aufgrund dieser Eigenschaf-ten wurde die GC-4spc Zellinie einem Differenzierungsstadium zwischen den PrĂ€leptotĂ€nspermatozyten und den frĂŒhen PachytĂ€nspermatozyten zugeordnet. Im folgenden wurde die GC-1spg- mit der GC-4spc Zellinie auf der Ebene des PhĂ€notyps so-wie auf der Ebene der Expression miteinander verglichen. Die Spermatogonienzellinie GC-1spg wurde von Hofmann et al. (1992) hergestellt und reprĂ€sentiert ein Differenzierungssta-dium zwischen den Spermatogonien des Typs B und den PrĂ€leptotĂ€nspermatozyten. Die GC-1spg Zellen wurden mit dem SV40 large T Antigen immortalisiert. Es zeigte sich, dass die GC-1spg Zellinie im Vergleich zur GC-4spc Zellinie stĂ€rker proliferiert und ein deutlich erhöhtes Invasionspotential besitzt. Ferner wurde eine Ăberexpression des Tumormarkers GCAP bzw. seines Maus-homologen EAP in der GC-1spg Zellinie festgestellt. In einem Pilotexperiment wurde demonstriert, dass nach subkutaner und intratestikulĂ€rer Applikation der GC-1spg Zellen in SCID-MĂ€use Tumoren entstehen, wohingegen es nach subkutaner und intratestikulĂ€rer Applikation der GC-4spc Zellen in SCID-MĂ€use zu keiner Tumorbildung kommt. Die durchgefĂŒhrten Studien zeigen eindeutig, dass es sich bei der Spermatogonienzellinie GC-1spg im Vergleich zur Spermatozytenzellinie GC-4spc um eine maligne transfor-mierte Zellinie handelt. Aus diesem Grund wurden ĂŒber die Methode der subtraktiven Hybri-disierung Gene isoliert, die in der GC-1spg Zellinie ĂŒberexprimiert sind und somit potentiell fĂŒr den malignen PhĂ€notyp der Zellinie verantwortlich sind. Insgesamt konnten 8 bekannte und 4 unbekannte cDNA Klone isoliert werden, die in der GC-1spg Zellinie differentiell exprimiert werden. Diese gelten als Kandidatengene fĂŒr den malignen PhĂ€notyp der GC-1spg Zellen. Ăber den experimentellen in vitro Ansatz konnte gezeigt werden, dass Spermatozyten keine SuszeptibilitĂ€t zur malignen Transformation besitzen. Dieses Ergebnis steht im Ein-klang mit den in vivo Ergebnissen der PGK2-LTA transgenen MĂ€use. Zum anderen konnte demonstriert werden, dass Spermatogonien in vitro die Potenz zur malignen Transformation besitzen. Um unbekannte, in der GC-1spg Zellinie ĂŒberexprimierte cDNA-Klone zu charakterisieren und mit dem malignen PhĂ€notyp der GC-1spg Zellen in Verbindung zu bringen, wurde der Klon 45 analysiert und charakterisiert. Die "full-length" cDNA der Maus und des Menschen wurden isoliert, und es zeigte sich eine hohe Homologie zum "Ngg1-interacting factor3" der Hefe, woraufhin die isolierte cDNA der Maus fortan mit Nif3l1 ("Ngg1 interacting factor3 like1") und die homologe humane "full-length" cDNA-Sequenz analog mit NIF3L1 bezeich-net wurde. Nif3l1 zeigt ein ubiquitĂ€res Expressionsmuster in sĂ€mtlichen analysierten Gewe-ben der Maus sowie eine Expression durch die gesamte embryonale Entwicklung. Desweiteren zeigt das Nif3l1-Gen eine starke Ăberexpression in der GC-1spg - sowie in der Teratokarzinomzellinie F9. Das Nif3l1-Gen der Maus wurde auf Chromosom 1, Region C lokalisiert. Das homologe humane NIF3L1-Gen konnte auf Chromosom 2q33 lokalisiert werden und besteht aus sieben Exons, die eine genomische Sequenz von ca. 14 kb umspannen. Ăber ein GFP-NIF3L1-Fusionsprotein erfolgte die zellulĂ€re Lokalisation von NIF3L1 im Zytoplasma. Es zeigte sich, dass die AminosĂ€uresequenz von NIF3L1 in den beiden flankierenden Regionen zwei DomĂ€nen besitzt, die innerhalb der Evolution konserviert wurden. Homologe Proteine finden sich von den Archaebakterien bis hinzu den SĂ€ugern. Ăber das Yeast-Two-Hybrid-System wurden zwei Interaktionspartner von NIF3L1 isoliert. Dabei handelt es sich zum einen um NIF3L1a-1, eine SpleiĂvariante von NIF3L1, die fĂŒr ein trunkiertes Protein von 350 AminosĂ€uren kodiert. Zum anderen handelt es sich um ein 204 AminosĂ€uren groĂes Protein, das mit IF1 (Interacting factor 1) bezeichnet wurde. Die im Yeast-Two-Hybrid gefundenen Interaktionen wurden im GST-Pulldown bzw. im Mammalian-Two-Hybrid-System verifiziert. Das humane IF1-Gen wurde auf Chromosom 3p14.1 lokalisiert und besteht aus 8 Exons, die eine genomische Sequenz von ungefĂ€hr 30 kb umspannen. Im weiteren Verlauf wurde die homologe If1-cDNA der Maus isoliert. Expressionsanalysen mit RNAs aus verschiedenen Geweben der Maus zeigten eine ubiquitĂ€re Expression von If1 sowie eine Expression von If1 durch die gesamte Embryonalentwicklung. Ăber ein GFP-IF1 Fusionsprotein wurde die zellulĂ€re Lokalisation von IF1 sowohl im Nucleus als auch im Zytoplasma bestimmt