Susceptibility of premeiotic male germ cells to malignant transformation

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Suszeptibilität der Spermatogonien und Spermatozyten zur malignen Transformation über einen experimentellen in vivo- und über einen experimentellen in vitro Ansatz evaluiert. Ziel des in vivo Ansatzes war es zu untersuchen, ob transgene Mäuse über eine zielgerichtete und stadienspezifische Expression eines viralen Onkogens in den Spermatozyten bzw. Spermatogonien maligne transformiert werden können. Als virales Onkogen wurde das SV40 large T Antigen (LTA) verwendet. Die stadienspezifische Expression des LTA in den Spermatozyten erfolgte unter der Kontrolle des humanen Phosphoglycerat-Kinase 2 (PGK2)-Promotors. Die generierten PGK2-LTA transgenen Mäuse zeigten eine testisspezifische Expression des large T Antigens ab dem postnatalen 12. Tag der testikulären Entwicklung, also im Stadium der Präleptotänspermatozyten. Auch nach 20 Monaten zeigten die PGK2-LTA transgenen Mäuse keine Tumorentwicklung im Testis oder in anderen Organen. Präpubertäre PGK2-LTA transgene Mäuse zeigten eine abnorme Keimzellproliferation, die sich in einer signifikanten und transienten Erhöhung der Anzahl an Spermatozyten manifestierte. In späteren Altersstadien assimilierte sich die erhöhte Anzahl der Spermatozyten in den transgenen Mäusen an die Anzahl in den Wildtypmäusen über Apoptose. Die Analyse der PGK2-LTA transgenen Mäuse demonstriert, dass Spermatozyten nicht die Potenz zur malignen Transformation aufweisen. Um das LTA stadienspezifisch in den Spermatogonien zu exprimieren, wurde der humane TSPY (testis-specific protein, Y-encoded)-Promotor als 5'-regulierende Sequenz verwendet. Insgesamt konnten zwei Linien (Linie 23 u. Linie 61) etabliert werden, die eine Expression von LTA im Testis aufweisen. Expressionsanalysen mit RNAs aus verschiedenen Geweben zeigten neben der Expression im Testis auch eine Expression in der Milz. Beim Founder 57 sowie bei mehreren Tieren in der Linie 23 traten im Alter von 3-4 Monaten Tumoren in der Sella turcica auf. Dabei handelt es sich vermutlich um Hypophysentumoren. Gegenwärtig werden diese Tumoren auf die Expression spezifischer Markergene analysiert, um die genaue Spezifität des Tumors zu determinieren. Die Analyse der TSPY-LTA transgenen Mäuse ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht abgeschlossen. Ziel des in vitro Ansatzes war es mit Hilfe von immortalisierten Keimzellinien die Potenz der Spermatozyten und der Spermatogonien zur malignen Transformation zu evaluieren. Die immortalisierte Spermatogonienzellinie GC-1spg und die immortalisierte Spermatozytenzellinie GC-4spc sollten auf der Ebene des Phänotyps sowie auf der Ebene der Expression miteinan-der verglichen werden. Zunächst wurde eine neue Spermatozytenzellinie GC-4spc der Maus unter Verwendung des Promotor-basierten Selektionsverfahrens hergestellt. Die etablierte GC-4spc Zellinie wächst adhärent und wurde bereits für mehr als 30 Generationen kultiviert. Außerdem weist die Zelllinie einen diploiden DNA-Gehalt auf, womit ausgeschlossen ist, dass die Zellen in vitro weiter in haploide Spermatiden differenzieren. Die GC-4spc Zellinie wurde auf ihre Stadienspezifität evaluiert. Dabei konnte eine Expression des Pgk2-Gens, des Proakrosin-Gens und des A-myb-Gens nachgewiesen werden. Bei der Maus werden diese Gene keimzellspezifisch exprimiert, darüber hinaus sind das Pgk2-Gen und das Proakrosin-Gen spezifische Expressionsmarker für Spermatozyten. Überdies zeigte eine 1.4 kb lange 5'-flankierende Sequenz des humanen PGK2-Gens eine erhöhte transkriptionelle Aktivität in der GC-4spc Zellinie. Ex-pressionsanalysen von Markergenen für andere Zelltypen im Testis wie Peritubular-Zellen, Sertoli-Zellen, Leydig-Zellen oder Makrophagen waren negativ. Aufgrund dieser Eigenschaf-ten wurde die GC-4spc Zellinie einem Differenzierungsstadium zwischen den Präleptotänspermatozyten und den frühen Pachytänspermatozyten zugeordnet. Im folgenden wurde die GC-1spg- mit der GC-4spc Zellinie auf der Ebene des Phänotyps so-wie auf der Ebene der Expression miteinander verglichen. Die Spermatogonienzellinie GC-1spg wurde von Hofmann et al. (1992) hergestellt und repräsentiert ein Differenzierungssta-dium zwischen den Spermatogonien des Typs B und den Präleptotänspermatozyten. Die GC-1spg Zellen wurden mit dem SV40 large T Antigen immortalisiert. Es zeigte sich, dass die GC-1spg Zellinie im Vergleich zur GC-4spc Zellinie stärker proliferiert und ein deutlich erhöhtes Invasionspotential besitzt. Ferner wurde eine Überexpression des Tumormarkers GCAP bzw. seines Maus-homologen EAP in der GC-1spg Zellinie festgestellt. In einem Pilotexperiment wurde demonstriert, dass nach subkutaner und intratestikulärer Applikation der GC-1spg Zellen in SCID-Mäuse Tumoren entstehen, wohingegen es nach subkutaner und intratestikulärer Applikation der GC-4spc Zellen in SCID-Mäuse zu keiner Tumorbildung kommt. Die durchgeführten Studien zeigen eindeutig, dass es sich bei der Spermatogonienzellinie GC-1spg im Vergleich zur Spermatozytenzellinie GC-4spc um eine maligne transfor-mierte Zellinie handelt. Aus diesem Grund wurden über die Methode der subtraktiven Hybri-disierung Gene isoliert, die in der GC-1spg Zellinie überexprimiert sind und somit potentiell für den malignen Phänotyp der Zellinie verantwortlich sind. Insgesamt konnten 8 bekannte und 4 unbekannte cDNA Klone isoliert werden, die in der GC-1spg Zellinie differentiell exprimiert werden. Diese gelten als Kandidatengene für den malignen Phänotyp der GC-1spg Zellen. Über den experimentellen in vitro Ansatz konnte gezeigt werden, dass Spermatozyten keine Suszeptibilität zur malignen Transformation besitzen. Dieses Ergebnis steht im Ein-klang mit den in vivo Ergebnissen der PGK2-LTA transgenen Mäuse. Zum anderen konnte demonstriert werden, dass Spermatogonien in vitro die Potenz zur malignen Transformation besitzen. Um unbekannte, in der GC-1spg Zellinie überexprimierte cDNA-Klone zu charakterisieren und mit dem malignen Phänotyp der GC-1spg Zellen in Verbindung zu bringen, wurde der Klon 45 analysiert und charakterisiert. Die "full-length" cDNA der Maus und des Menschen wurden isoliert, und es zeigte sich eine hohe Homologie zum "Ngg1-interacting factor3" der Hefe, woraufhin die isolierte cDNA der Maus fortan mit Nif3l1 ("Ngg1 interacting factor3 like1") und die homologe humane "full-length" cDNA-Sequenz analog mit NIF3L1 bezeich-net wurde. Nif3l1 zeigt ein ubiquitäres Expressionsmuster in sämtlichen analysierten Gewe-ben der Maus sowie eine Expression durch die gesamte embryonale Entwicklung. Desweiteren zeigt das Nif3l1-Gen eine starke Überexpression in der GC-1spg - sowie in der Teratokarzinomzellinie F9. Das Nif3l1-Gen der Maus wurde auf Chromosom 1, Region C lokalisiert. Das homologe humane NIF3L1-Gen konnte auf Chromosom 2q33 lokalisiert werden und besteht aus sieben Exons, die eine genomische Sequenz von ca. 14 kb umspannen. Über ein GFP-NIF3L1-Fusionsprotein erfolgte die zelluläre Lokalisation von NIF3L1 im Zytoplasma. Es zeigte sich, dass die Aminosäuresequenz von NIF3L1 in den beiden flankierenden Regionen zwei Domänen besitzt, die innerhalb der Evolution konserviert wurden. Homologe Proteine finden sich von den Archaebakterien bis hinzu den Säugern. Über das Yeast-Two-Hybrid-System wurden zwei Interaktionspartner von NIF3L1 isoliert. Dabei handelt es sich zum einen um NIF3L1a-1, eine Spleißvariante von NIF3L1, die für ein trunkiertes Protein von 350 Aminosäuren kodiert. Zum anderen handelt es sich um ein 204 Aminosäuren großes Protein, das mit IF1 (Interacting factor 1) bezeichnet wurde. Die im Yeast-Two-Hybrid gefundenen Interaktionen wurden im GST-Pulldown bzw. im Mammalian-Two-Hybrid-System verifiziert. Das humane IF1-Gen wurde auf Chromosom 3p14.1 lokalisiert und besteht aus 8 Exons, die eine genomische Sequenz von ungefähr 30 kb umspannen. Im weiteren Verlauf wurde die homologe If1-cDNA der Maus isoliert. Expressionsanalysen mit RNAs aus verschiedenen Geweben der Maus zeigten eine ubiquitäre Expression von If1 sowie eine Expression von If1 durch die gesamte Embryonalentwicklung. Über ein GFP-IF1 Fusionsprotein wurde die zelluläre Lokalisation von IF1 sowohl im Nucleus als auch im Zytoplasma bestimmt