Low survival rate and muscle fiber-dependent aging effects in the McArdle disease mouse model

Survival rate; McArdle disease; Mouse modelTaxa de supervivència; Malaltia de McArdle; Model de ratolíTasa de supervivencia; Enfermedad de McArdle; Modelo de ratónMcArdle disease is an autosomal recessive disorder caused by the absence of the muscle glycogen phosphorylase, which leads to impairment of glycogen breakdown. The McArdle mouse, a model heavily affected by glycogen accumulation and exercise intolerance, was used to characterize disease progression at three different ages. The molecular and histopathological consequences of the disease were analyzed in five different hind-limb muscles (soleus, extensor digitorum longus, tibialis anterior, gastrocnemius and quadriceps) of young (8-week-old), adult (35-week-old) and old (70-week-old) mice. We found that McArdle mice have a high perinatal and post-weaning mortality. We also observed a progressive muscle degeneration, fibrosis and inflammation process that was not associated with an increase in muscle glycogen content during aging. Additionally, this progressive degeneration varied among muscle and fiber types. Finally, the lack of glycogen content increase was associated with the inactivation of glycogen synthase and not with compensatory expression of the Pygl and/or Pygb genes in mature muscle.ISCIII CD14/00032/Ministry of Economy and Competitiveness | Instituto de Salud Carlos III (Institute of Health Carlos III

Modelos celulares de la enfermedad de McArdle: evaluación de la terapia farmacológica con agentes read-through, características del metabolismo energético y de la vía de la autofagia

La malaltia de McArdle o glucogenosi tipus V es una malaltia del metabolisme del glucogen causada per mutacions patogèniques en ambdues copies del gen PYGM, que codifica per a la isoforma muscular del enzim glucogen fosforilasa (GP-M o miofosforilasa). Este dèficit provoca la incapacitat para degradar el glucogen en el múscul i els pacients presenten com a tret fenotípic principal la intolerància al exercici, podent arribar a rabdomiòlisis. Actualment no existeix cap tractament efectiu per a la malaltia de McArdle. La mutació mes comú entre els pacients es la p.R50X que provoca a un codó de terminació prematur (PTC). Els agents read-through (RTAs) son petites molècules que tenen la capacitat de induir un efecte read-through sobre un PTC, produint la lectura completa de la proteïna. Per aquest motiu, en el present treball s’avalua la hipòtesis de que el tractament farmacològic amb RTAs pot restablir el mínim de proteïna GP-M per a la millora del fenotip en els pacients de McArdle. Amb aquest objectiu s’han estudiat els compostos G418, Ataluren, Amlexanox y RTC13 en dos models cel·lulars de la malaltia de McArdle: cultius de cèl·lules HeLa transfectades amb plàsmids que contenen el PTC p.R50X y cultius de cèl·lules provinents de músculs del model murí de la malaltia de McArdle. Els RTAs avaluats no han aconseguit produir un efecte read-through en els models utilitzats. Per altra banda, en el present treball també es planteja la hipòtesis de que la incapacitat de utilitzar el glucogen com font d’energia en els pacients de McArdle produeix canvis metabòlics adaptatius. Esta hipòtesis s’ha avaluat en dos sistemes, músculs de ratolins del model de McArdle y cultius cel·lulars procedents del mateix. A través d’estudis dels paràmetres bioquímics en els medis de cultiu i anàlisis proteics d’enzims implicats en les vies metabòliques de ambdós models, s’han observat alteracions en el metabolisme de les vies energètiques i en la via degradativa de la autofàgia. S’ha comprovat que estes alteracions varien en funció dels subministres energètics del medi (glucosa, àcid palmític y dejú). La via de la autofàgia suposa un sistema alternatiu a la degradació citoplasmàtica de glucogen mitjançant la degradació lisosomal, amb la qual cosa la modulació de esta via podria ser una nova via per a la millora del fenotip dels pacients McArdle.La enfermedad de McArdle o glucogenosis tipo V es una enfermedad del metabolismo del glucógeno causada por mutaciones patogénicas en ambas copias del gen PYGM, que codifica para la isoforma muscular de la enzima glucógeno fosforilasa (GP-M o miofosforilasa). Este déficit conduce a la incapacidad para degradar el glucógeno en el músculo y los pacientes presentan como rasgo fenotípico principal la intolerancia al ejercicio, pudiendo llegar a rabdomiolisis. Actualmente no existe ningún tratamiento efectivo para la enfermedad de McArdle. La mutación más común entre los pacientes es la p.R50X que conduce a un codón de terminación prematuro (PTC). Los agentes read-through (RTAs) son pequeñas moléculas que tienen la capacidad de inducir un efecto read-through sobre un PTC, produciendo la lectura completa de la proteína. Por este motivo en el presente trabajo se evalúa la hipótesis de que el tratamiento farmacológico con RTAs puede reestablecer el mínimo de proteína GP-M para la mejora del fenotipo en los pacientes de McArdle. Para ello se han estudiado los compuestos G418, Ataluren, Amlexanox y RTC13 en dos modelos celulares de la enfermedad de McArdle: cultivos de células HeLa transfectadas con plásmidos que contienen el PTC p.R50X y cultivos de células provenientes de músculos del modelo murino de la enfermedad de McArdle. Los RTAs evaluados no han conseguido producir un efecto read-through en los modelos utilizados. Por otra parte, en el presente trabajo también se plantea la hipótesis de que la incapacidad de utilizar el glucógeno como fuente de energía en los pacientes de McArdle produce cambios metabólicos adaptativos. Esta hipótesis se ha evaluado en dos sistemas, músculos de ratones del modelo de McArdle y cultivos celulares procedentes del mismo. A través de estudios de los parámetros bioquímicos en los medios de cultivo y análisis proteicos de enzimas implicadas en las vías metabólicas de ambos modelos, se han observado alteraciones en el metabolismo de las vías energéticas y en la vía degradativa de la autofagia. Se ha comprobado que estas alteraciones varían en función de los aportes energéticos del medio (glucosa, ácido palmítico y ayuno). La vía de la autofagia supone un sistema alternativo a la degradación citoplasmática de glucógeno por medio de degradación lisosomal, por lo que la modulación de esta vía podría ser una nueva vía para la mejoría del fenotipo de los pacientes McArdle.McArdle disease or GSD type V is a glycogen metabolism disease caused by mutation in both copies of PYGM gene, which codifies for the muscular isoform of glycogen phosphorylase (GP-M or myophosphorilase). The patients are unable to use glycogen as energy source, and as a consequence they experience exercise intolerance, that can lead to rhabdomyolysis. Nowadays there is no effective therapy for the McArdle disease. Most prevalent mutation in McArdle’s patients is p.R50X, which produces a Premature Termination Codon (PTC). Read-through agents (RTAs) are small molecules with the capacity to induce a read-through effect on a PTC, producing full-length protein synthesis. For this reason, in the present work the hypothesis that the pharmacological treatment with RTAs can restore a minimum amount of protein to improve the phenotype of the patients is evaluated. In order to do this we have tested the G418, Ataluren, Amlexanox and RTC13 compounds in two cellular models of McArdle disease: cultured HeLa cells transfected with a plasmid containing the p.R50X PTC and cultured muscular cells from the McArdle mouse model. The RTAs tested were unable to produce a read-through effect in both cellular models. Furthermore, it is also evaluated the hypothesis that the incapability of using glycogen as an energy source produces adaptative metabolic changes. This hypothesis has been tested in two different systems: in the skeletal muscle from the McArdle mouse model and in skeletal muscle cultures derived from the same model. Through biochemical values and protein analysis of metabolic pathways related enzymes of both models, we have observed alterations in energetic metabolic pathways and the degradative pathway of autophagy. It is verified that these alterations may vary depending on the medium composition in energetic compounds (glucose, palmitic acid, fasting). Autophagy pathway is an alternative system of glycogen cytoplasmic degradation in lysosomal organelles, so the modulation of this pathway may be a new opportunity for the phenotype improvement of the McArdle patients.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicin

Performance of Massive Parallel Sequencing-Based Cell-Free DNA Testing in Compromised Pregnancies

Cell free fetal DNA analysis; Early pregnancy loss; Fetal ultrasound abnormalityAnàlisi d'ADN fetal lliure de cèl·lules; Avort espontani; Anomalia de l'ecografia fetalAnálisis de ADN fetal libre de células; Aborot espontáneo; Anomalía en la ecografía fetalBackground/Objectives: Non-Invasive prenatal test (NIPT) is used as a universal or contingent test after prior risk assessment. Screening is mainly performed for common trisomies (T21, T13, T18), although other chromosomal anomalies may be detected. Our objective was to study the performance of GWNIPT in the detection of chromosomal abnormalities in pregnancies in which an invasive prenatal study was performed and in early pregnancy losses, in comparison with the reference test. Method: VeriSeqTM NIPT Solution v2, a genome-wide NIPT (GWNIPT), was performed prior to invasive testing in fetal diagnostic study cases (FDS, n = 155) and in early pregnancy losses (EPL, n = 68). Results: In the FDS group, the diagnostic test (QFPCR, array and karyotype) detected anomalies in 32 pregnancies (21%), in twenty of them (61%) also detected by GWNIPT. Eleven of the twelve cases undetected by GWNIPT were balanced translocations (n = 4) or deletions/duplications <7 Mb (n = 7). In the EPL group, GWNIPT detected anomalies in 46% of cases (31/68) but comparison with reference test (QFPCR and karyotype) in products of conception (POC) was only possible in 18 cases. Concordant results between POC and GWNIPT test were obtained in 16 of the 18 cases. In EPL, with GWNIPT testing, common trisomies accounted for 25.8% of cases (8/31), rare trisomies 54.8% (17/31) and microdeletions/duplications 16.1% (5/31). Conclusions: The GWNIPT test may be useful in clinical practice in prenatal and in EPL’s genetic diagnosis when the appropriate sample is not available