ヒト由来チオキドキシン還元酵素のカルボキシル末端配列の酸化還元状態の半経験的分子軌道計算

Semiempirical molecular orbital calculation (MOPAC) was used to estimate the enthalpy difference (ΔH) between the reduce and oxidized states of the C-terminal rebox center of human thioredoxin reductase. Heat of formation was computed by WinMOPAC 3.5Pro for the model peptides, N-Acetyl-Ser-Ile-Leu-Gly-X1-X2-Gly, whose-X1-X2-sequence was-Cys SeCys-(natural sequence), -SeCys-Cys-(reverse sequence), -Cys-Cys, and-SeCys-SeCys-. Calculation by Hamiltonian AM1 and PM3 agreed that the oxidized state with selenosulfide bonds and a diselenide bond were more favoralbe than their reduced states. Only the peptide that contained-Cys-Cys-sequence was shown to have lower enthalpy when the two Cys were in the reduced form. It has been reported that substitution of SeCys498 to Cys results in the mujtant TrxRs retaining only about 1% of the enzyme activity. The results of computational estimation supported the experimental hypothesis that the inactivation by SeCys498Cys mutation was due to the unfavorable formation of disulfide bond between Cys497-Cys498.ヒトのチオレドキシン還元酵素（TrxR）のカルボキシル末端配列の酸化還元に伴うエンタルピー変化を計算した。半経験的分子軌道計算 WinMOPAC 3.5Pro を用いてモデルペプチド、N-Ac-Ser-Ile-Leu-Gln-Ala-Gly-X1-X2-Gly の生成熱を算出した。X1,X2のアミノ酸配列は-SeCys-Cys、 -Cys-SeCys-、 -SeCys-SeCys-、 -Cys-Cys- のいずれかで、それぞれ酸化状態と還元状態を計算し、そのエンタルピー差を求めた。ハミルトニアン AM1 と PM3は同じ傾向の計算結果を示し、セレノスルフィドまたはジセレニドを形成するペプチドは酸化状態でより安定化するのに対して-Cys-Cys-の配列を持つペプチドは還元型の方が安定的であることを示した。ほ乳類の TrxR の SeCys498 を Cys に置換すると酵素活性が1%程度にまで低下することが報告されている。これは、変異酵素が -Cys497-Cys498- 間で酸化的架橋を形成しにくいからと考察されていたが、今回の分子軌道計算の結果は、この仮説を支持している

Screening Isolation and Characterization of Thermophilic and Acidophilic Bacteria

We have isolated 53 thermophilic and acidophilic bacteria from about 150 samples from acidic hot springs. All the strains isolated exhibited growth only at high temperatures and low pH ranges. We extensively characterized the strain UZ-1 which was isolated from Unzen spa. This strain was found to be a gram-negative, aerobic and heterotrophic bacterium. The DNA base composition was 63 mol% GC. Growth occurs over a range of 37℃ to 65℃ with an optimum temperature of 60℃, and between pH 2.0 and pH 6.0 with an optimum pH of 3.0. On the other hand, the optimum temperature of the other 6 isolated strains was 70℃. We report, in this paper, the characteristics of the isolated strains.我々、人間を含め生物が最も広く、かつ最も多く分布している所は、中性付近のpH,20℃~37℃の温度、1気圧、そして適当な栄養素と塩分を含んでいる場所である。その一方、地球上には我々の目から見て生命の存在が許されないような環境、すなわち極限(特殊)環境が多数ある。高温地帯、高塩濃度の塩湖、強酸あるいは強アルカリ性の場所、そして光も届かない海底等がそれに該当する。近年では、生物によって非常に過酷と思われる極限環境に好んで棲息する微生物が数多く単離されている。これらの微生物群は極限環境微生物と総称されている。極限環境微生物は、自分のおかれた環境に適応するために種々の特殊な能力を獲得してきた。特殊な能力ゆえに、最近では利用の幅も広がってきている。1970年代以降、好アルカリ性細菌由来のプロテアーゼ及びセルラーゼが衣料用洗剤に配合されるようになった。海底から石油分解細菌が単離されており、応用研究に期待がもたれている。人間が発見してきた極限環境微生物はほんの氷山の一角にしか過ぎず、今後、人類にとってさらに有益な微生物が単離されるかもしれない。以上のようなことから、この分野の研究は大きな可能性を秘めたものであると思われる。我々の研究室では、極限環境微生物の中でも特に好酸性細菌に焦点を当てて研究を行ってきた。Acidiphilium属細菌は、1981年にアメリカのハリソンにより初めて単離された一群の好酸性従属栄養細菌(1属6種)である1)。我々は、これまでにAcidiphilium属細菌より、各種制限酵素2)~7)、グリセロール3-リン酸デヒドゲナーゼ8)などの有用酵素の検索、単離、精製を行ってきた。また、同じく好酸性の従属栄養細菌である。Acidobacterium属細菌より、β-グルコシダーゼなどの糖質関連酵素の精製も行ってきた9)。それらと並行してAcidiphilium属細菌の分子育種の系の確立を目指して、宿主ベクター系の開発も進めてきた10),11)。一方、高温環境の好んで棲息する好熱性細菌はタンパク質の大部分が変性する60℃以上の世界でも生育できることから、産生する酵素の耐熱性について詳細に研究されてきた。その結果、高熱性細菌の酵素より得られた知見を基に、部位特異的変異の手法を用いて常温菌の酵素の熱安定性を人為的に向上できるまでに至った。その他にも、好熱性細菌の研究は遺伝子工学や進化生物の発展上、大きな役割を担ってきた。高度好熱性細菌Thermusaquaticus由来のDNAポリメラーゼが12)、PCR技術の発達に寄与し、分子生物学分野のみならず犯罪捜査の際のDNA鑑定等に応用されているのは、その代表例の一例である。これらのことから好熱性と好酸性の両方性質を併せ持つ好熱性好酸性細菌に注目し検索、単離及び諸性質の検討を試みた。全国各地の泉質が酸性である温泉でサンプルを採取して、それから53株の好熱性好酸性細菌を単離することがでた。以下に単離菌株の諸性質に関する研究を報告する

Studies on Anti-cancer Enzyme, Methionine γ-lyase

Methionine γ-lyase, a pyridoxal-p dependent enzyme which was purified from Pseudomonas putida catalyzes α, γ-elimination and γ-replacement reactions of L-methionine and its derivatives, and also α, β-elimination and β-replacement reactions of S-substitude cysteines. The unique catalytic mechanism of methionine γ-lyase was studied using 1-vinylglycine and the mechanisms of inactivations were studied using suicide substrates, L-propargylglycine, S-(N-methylthiocarbamoyl)-L-cysteine and L-2-amino-4-pantanoate. The enzyme also catalyzes the rapid exchange of the α-and β-hydrogens of methionine and other amino acids with deuterrium from solvents. From these studies, mechanisms for α-and β-hydrogens of the substrate amino acids are initially removed, and then the γ-substitute is eliminated to yield a vinylglycinepyridoxal-P intermediate, which is a common key intermediate in α, γ-elimination and γ- replacement reactions. In addition, the gene encoding this enzyme was cloned and the primary structure of the enzyme was deduced from its nucleotide sequences. The methionine γ-lyase gene was expressed in Escherichia coli. We found a part of an open reading frame (termed mdeB) in the 3'-franking region of the L-methionine γ-lyase gene, suggesting the presence of an operon involved in methionine catabolism. The deduced amino acid sequence of MdeB showed a high homology with the N-terminal region of E1 component of pyruvte dehydrogenase complex from E. coli. We purified and characterized the novel α-ketobutyrate decarboxylase(MdeB) from E. coli transformant. Some of its properties were described

Isolation,Identification and Characterization of the Aminoacylase Inhibitors from Actinomycetes

アミノアシラーゼは固定化酵素として工業的に利用された最初の酵素であり,その応用面において精力的な研究がなされてきた.しかし,その生理学的及び酵素学的な面での研究はほとんど進展していない.本酵素の基礎面を研究する一つのアプローチとして,本酵素の阻害物質を放線菌を用いて検索し,2種の異なる阻害物質(Ⅰ,II)を見いだした.各種クロマトグラフィーにより阻害物質Ⅰを単一に精製し,機器分析にかけた結果,本物質はDL-乳酸であり,その阻害活性はL体にのみ認められた.各種α-ヒドロキシカルボン酸についてその阻害活性を検索したところ,DL-α-ヒドロキシ-n-酪酸,DL-α-ヒドロキシ-n-吉草酸,DL-α-ヒドロキシ-n-カプロン酸,L-β-フェニル乳酸が乳酸を上回る阻害活性を示した.最も強い阻害活性を示したDL-α-ヒドロキシ-n-カプロン酸のKiは約15μMでL-乳酸の0.9mMと比較すると,かなり低濃度で阻害を示すことが認められた.いずれの物質の阻害形式も基質に対して非拮抗的であった

Structural Analysis of the mde Operon lnvolved in L-Methionine Degradative Metabolism of Pseudomonas putida

The mde operon and an upstream regulatory gene (mdeR) have been cloned and sequenced from Pseudomonas putida chromosomal DNA. The mde operon contains two structural genes involved in L-methionine degradative metabolism, which are mdeA (L-methionine γ-lyase gene) and mdeB (a gene encoding a homologous protein to the E1 component of pyruvate dehydrogenase complex). A rho-independent terminator was present just downstream of mdeB and open reading frames corresponding to other components of α-keto acid dehydrogenase complex were not found. When the mdeB gene product was overproduced in Escherichia coli, the E1 activity of the cell extract showed high specificity for α-ketobutyrate rather than pyruvate. these results suggest that mdeB encodes a novel E1 component, α-ketobutyrate dehydrogenase E1 component, and plays an important role in the metabolism of α-ketobutyrate produced by L-methionine γ-lyase from L-methionine. In addition,we found that mdeR gene was located on the opposite strand and began at 127 bp from the translational start site of mdeA. The mdeR gene product has been idetified as a member of the leucine responsive regulatory protein (Lrp) family and revealed to act as an essential positive regulator allowing the expression of the mdeAB operon.mdeオペロン及びその上流調節遺伝子(mdeR)がPseudomonas putida染色体DNAからクローニングされ、これらの遺伝子の塩基配列が決定された。mdeオペロンは、L-メチオニン分解代謝に伴われる2つの構造遺伝子mdeA (L-メチオニン　γ-リアーゼ遺伝子)及び、mdeB(ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のE1成分に相同性のあるタンパク質をコードする遺伝子)を含んでいた。ロー因子非依存型のターミネーター構造がmdeBのすぐ下流に存在し、α-ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の他の成分に相当するオープンリーディングフレームは見られなかった。mdeB産物が大腸菌中で過剰発現されたとき、その細胞抽出液は、ピルビン酸よりもむしろα-ケト酪酸に対し高い特異性を持つE1活性を示した。すなわちmdeB遺伝子は新規のE1成分であるα-ケト酪酸デヒドロゲナーゼE1成分をコードしており、L-メチオニンからL-メチオニンγ-リアーゼによって生産されたα-ケト酪酸の代謝に、mdeBが重要な役割を果たすことが示唆された。さらに我々は、mdeA遺伝子の翻訳開始点から127bp上流反対方向にコードされるmdeR遺伝子を見い出した。mdeR産物は、ロイシン応答調節タンパク質(Lrp)ファミリーの一つとして同定され、mdeABオペロンの発現に必須な正の調整因子として作用することが明らかとなった

Integral Effects of Systemic Nitric Oxide Synthase Inhibition on Carotid Arterial Compliance

Decreased arterial compliance (increased arterial stiffness) is associated with cardiovascular events. Nitric oxide regulates vascular tone, which can influence arterial compliance. We previously investigated the effects of systemic nitric oxide synthase (NOS) inhibition on arterial compliance under the systemic α-adrenergic receptor blocking. In the present study, we investigated the effect of systemic NOS inhibition alone on central arterial compliance (via carotid arterial ultrasound imaging and applanation tonometry). Eighteen apparently healthy young adults (26±1 years) underwent intravenous infusions of NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) or placebo (saline) on separate days. In the placebo control condition, no significant changes were observed in mean arterial pressure, cross-sectional compliance, and β-stiffness index. Mean arterial pressure increased significantly (84±2 vs. 96±3 mmHg) after the administration of L-NMMA, whereas there were no significant changes in cross-sectional compliance (0.11±0.01 vs. 0.12±0.01 mm2/mmHg), β-stiffness index (6.44±0.37 vs. 5.51±0.41 unit), or isobaric arterial compliance. Theses results in young healthy adults are not consistent with the idea that carotid arterial compliance is modulated by nitric oxide. Grant Support: This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan (18300215, 18650186), JSPS Postdoctoral Fellowships for Research Abroad, and NIH grant AG20966

ＵＶ照射とプロトプラスト再生法によるStreptomyces incarnatusのリファンビシン耐性とシネフンギン生産性の向上

Secondary metabolite production by gram-positive bacteria is strictly regulated at the transcription of the biosynthetic genes to mRNA in response to certain stringent conditions. Therefore, some mutational disruption of regulatory domains of the bacterial RNA polymerase might increase the production of the antibiotics. In this study, we have attempted to improve the sinefungin-producing strain of Streptomyces incarnatus NRRL 8057 by irradiating ultraviolet light on the protoplast, and selecting mutants that acquired the resistance to rifampicin, the antibiotic which specifically binds to the β-subunit of bacterial RNA polymerase. After three rounds of mutation, 10 strains were obtained with varied resistance to rifampicin. A mutant which showed the highest resistance was found to have the highest sinefungin production, which was 2.4 times higher(0.45±0.11μg/ml)than the wild type strain (0.19±0.07μg/ml). The breeding approach by rifampicin-resistance may be advantageous over the classical random screening since it requires much smaller number of candidates to be examined.グラム陽性菌の二次代謝は，貧栄養条件などの緊縮応答として，その生合成遺伝子の転写段階が厳密な制御を受けている．そこで，これらのバクテリアのRNAポリメラーゼの制御部位を突然変異導入により破壊すれば，二次代謝産物の生産性向上が期待できる．本研究ではシネフンギンを生産するStreptomycesincarnatusNRRL8057プロトプラストに紫外線を照射して，RNAポリメラーゼ阻害剤であるリファンピシンに耐性を獲得した変異株を取得した．突然変異操作を三回行なった結果，異なるリファンピシン耐性を持つ突然変異株10株を得た．この中で最も高い耐性を示した突然変異株が最も高いシネフンギン生産能を示し，その生産性（0.45±0.11μg/ml）は野生株（0.19±0.07μg/ml）の約2.4倍あった．リァンピシン耐性を指標とする菌株の改良は，ランダムなスクリーニングを行なうよりも効率よく選抜を行うことができるという点で有効であるといえ

Saccharomyces cerevisiae 由来 D-アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの精製と性質

Some properties of D-amino scid acetyltransferase purified from Saccharomyces cerevisiae were investigated. The enzyme was purified to homogeneity by ammonium sulfate fractionation, column chromatographies on DEAE-Toyopearl 650M, Sephacryl S-200, QAE-Toyopearl 550C and affinity chromatography with D-glutamate as a ligand. The molecular weight was estimated to be about 53,000 by gel filtration. Relative molecular mass studies indicated that the enzyme was a monomer structure. The purified enzyme had an optimum pH of 8.4 and an optimum temperature of 40C. The Km values of the purified enzyme determined with tryptophan and acetyl-CoA were 4.5 * 10 -3M, respectively. The 20 residues of N-terminal amino acid sequence were analyzed

好酸性細菌 Acidiphilium organovorum 由来のアラニンセマーゼ

Alanine racemase(EC 5.1.1.1)was screened from several acidophilic bacteria.Acidiphilium organovorum 13H showed the highest activity and was chosen as the representative source to study alaine racemase from acidphlic bacteria.The enzyme was found to be localised in the cytoplasm of the bacteria.Relative molecular mass syudies indicated that it had a dimeric native structure with identical subunits of about 34 kDa each.Maximum activity was observed between 50 and 60℃and at pH9.There was no loss of enzyme activity even after incubation at 65℃.The loss of activity upon dialysis against pyridoxal 5'-phosphate-free buffer containing hydroxylamine,and its partial recovery upon subsequent dialysis against buffer containing phyridoxal 5'-phosphate suggested that the enzyme required piridoxal 5'-phosphate as a co-factor for its catalytic activity.Acidiphilium属好酸性細菌中のアラニンラセマーゼ活性を検索した。Acidiphilium organovorum 13Hが最も高い活性を示したので、好酸性細菌由来の代表的なアラニンラセマーゼとして研究対象とした。本酵素の局在性を調べたところ、細胞質に存在することが明らかとなった。また本酵素は同一のサブユニット（約34ｋDa）からなる二重構造体をとることが示された。至適反応条件は50-60℃、pH9であった。また65℃で30分のインキュベーション後も活性が失われず、熱さに対して比較的安定な酵素であった。Hydroxylamineによる透析で活性が失われ、これをpyriodoxal 5'-phosphate を含む緩衝液により透析をした結果、活性が部分的に回復したことから、本酵素はpyridoxial 5'-phosphateを補酵素として要求することが示唆された