Finishing the euchromatic sequence of the human genome

The sequence of the human genome encodes the genetic instructions for human physiology, as well as rich information about human evolution. In 2001, the International Human Genome Sequencing Consortium reported a draft sequence of the euchromatic portion of the human genome. Since then, the international collaboration has worked to convert this draft into a genome sequence with high accuracy and nearly complete coverage. Here, we report the result of this finishing process. The current genome sequence (Build 35) contains 2.85 billion nucleotides interrupted by only 341 gaps. It covers ∼99% of the euchromatic genome and is accurate to an error rate of ∼1 event per 100,000 bases. Many of the remaining euchromatic gaps are associated with segmental duplications and will require focused work with new methods. The near-complete sequence, the first for a vertebrate, greatly improves the precision of biological analyses of the human genome including studies of gene number, birth and death. Notably, the human enome seems to encode only 20,000-25,000 protein-coding genes. The genome sequence reported here should serve as a firm foundation for biomedical research in the decades ahead

Ginkgolide Production in Ginkgo biloba Trees and Cultured Cells

イチョウ植物体の種々の部位と，数種の培養細胞におけるギンコライド含有量を調べた。イチョウ植物体では，今回調べた緑葉，落葉，木部，外樹皮及び内樹皮，根，さらに胚乳の全てにおいてギンコライド類が検出された。落葉での含有量は緑葉と比較してかなり少なかった。4月に採取した内樹皮にはかなりの量が含まれていたが，外樹皮はその半分，木部ではさらに少量であった。10月に採取した若木の根には緑葉の約3倍の総ギンコライド量が検出された。胚乳ではギンコライドBが主成分で，ギンコライドA，Cははるかに少量であった。胚，葉柄，形成層由来の培養細胞でのギンコライド生成を調べたところ，数種の培養細胞でギンコライドBの生成が確認されたが，その量は原植物における含有量と比較してはるかに少なかった。胚由来の培養細胞では総じてギンコライドB生成が認められたが，葉柄および形成層由来の細胞でのギンコライド含有量はより少量であった。明所培養の細胞は緑色を呈するが，このこととギンコライド生成との関連は認められなかった。Ginkgolide content in various parts of ginkgo trees and in some cultured cells were studied. In all the parts of ginkgo trees examined, green and fallen leaves, wood, outer and inner barks, roots, and albumens, ginkgolides were detected. Fallen leaves had rather less ginkgolides than green leaves. Inner bark collected in April contained substantial amounts of ginkgolides, whereas outer bark had half the amount and wood had far less. In the roots of young trees collected in October, the amount of total ginkgolides was about three times as high as that of green leaves. In albumens, ginkgolide B was the main ingredient, and ginkgolides A and C were far less. Ginkgolide production was examined in cultured cells derived from embryo, petiole and cambium. Several cultured cells produced ginkgolide B, but the concentration was far less than any part of mother plants. Embryo-derived cultured cells generally produced ginkgolide B, while petiole- and cambium-derived calli showed poorer results. Greening of the cultured cells under illumination seemed to have no connection with ginkgolide production

Menadione-induced cell death in Ginkgo biloba cell cultures

Menadione induces apoptosis in the cells of many animal species and of some plant species. We report here on the detection of apoptotic features in menadione-treated ginkgo suspensioncultured cells. Treatment of gingko cells with menadione at concentrations of 300 and 1000μM caused a rapid loss of cell viability, and agarose gel electrophoresis of DNA extracted from the dying cells revealed the ladder pattern that is one of the hallmarks of apoptosis. Increases in superoxide anion and hydrogen peroxide levels were observed in the culture within a few seconds after menadione addition. The effects of known apoptosis inhibitors on menadione-induced cell injury were also examined. Catalase, superoxide dismutase (SOD), and a caspase-specific inhibitor had little or no inhibitory effect on the loss of cell viability. Treatment with several concentrations of the immunosuppressive drug cyclosporin A (CsA), which prevents mitochondrial dysfunction, reduced DNA fragmentation in a dose-dependent manner, but did not inhibit the loss of cell viability. These results show that menadione induces apoptotic cell death in ginkgo cells and that mitochondria may play a role in the cell degradation process.メナジオンは，多くの動物細胞及びいくつかの植物細胞においてアポトーシスを誘導することが知られている。本稿では，イチョウ懸濁培養細胞をメナジオン処理した際に観察されるアポトーシス様の細胞死について報告する。イチョウ懸濁培養細胞を300μM又は1000μMのメナジオンで処理することにより，細胞生存率の急速な低下が引き起こされるとともに，それらの細胞から抽出したDNA の電気泳動像が，アポトーシスの特徴のひとつであるラダー状のパターンを呈することが明らかになった。また，メナジオン処理の後数秒以内に細胞系中のスーパーオキサイドアニオン及び過酸化水素の濃度が上昇することが確認された。メナジオンによる細胞傷害に対する，既知のアポトーシス阻害剤の影響についても検討した。カタラーゼ，スーパーオキサイドディスムターゼ，及びカスパーゼ特異的阻害剤は細胞生存率の低下をほとんど抑制しなかった。サイクロスポリンAは，用量依存的にDNAの分解を軽減したが，細胞生存率の低下は抑制しなかった。サイクロスポリンAは免疫抑制剤であり，ミトコンドリアの機能障害を抑制する作用を持つことが知られている。これらの結果から，メナジオンはイチョウ培養細胞においてアポトーシス様の細胞死を誘導すること，及びメナジオン処理細胞での細胞の分解過程にミトコンドリアが関与している可能性があることが示された

Hormonal Responses of Petioles and Embryos in Ginkgo biloba Cultures

Petioles and embryos of Ginkgo biloba were cultured on modified Linsmaier & Skoog medium supplemented with various kinds and concentrations of auxins and cytokinins. Calli were easily obtained on the medium supplemented with various combinations of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid or naphthaleneacetic acid as an auxin, and kinetin or 6-benzyladenine as a cytokinin. The calli grew rapidly and were able to be subcultured on the same medium. These calli were white in color in the dark, but exposed to light, they easily changed to green. Organogenesis was not observed in petiole explants, but embryos excised from the seeds immediately after their falling to the ground showed germination and leaf expansion on the medium supplemented with indoleacetic acid (IAA) or indolebutyric acid (IBA) alone. When embryos excised from the seeds stored at 3℃ for about 3 months were used, they germinated and seedlings were obtained not only on IAA or IBA containing medium but also on a hormone-free one. Redifferentiation from calli was not seen by combining of growth regulators or modifying the mineral salt in the medium.イチョウの葉柄ならびに胚を外植片として用い，改変Linsmaier & Skoog培地にオーキシンとサイトカイニンの種類と濃度を変えて添加した培地で培養した。オーキシンとして2,4-DまたはNAA，サイトカイニンとしてBAまたはカイネチンを組み合わせて添加すると脱分化が容易に起こり成長の速いカルスが得られ，継代して培養が可能であった。このカルスは，暗所では白色をしているが光照射により容易に緑化した。葉柄からの分化は観察されていないが，落下直後の果実から取りだした胚をIAAまたはIBAのみを加えた培地で培養したところ，発芽して葉の展開が見られる場合があった。また，3℃で3カ月間保存した種子から取りだした胚を用いた場合，ホルモンを加えない培地においても発芽がみられ完全な幼植物体になるものもあった。一方，カルスからの再分化は，成長調節物質の組み合わせや培地の無機塩の改変によっては認められなかった

A phenylalanine ammonia-lyase gene (ErPAL1) from Eucalyptus robusta : molecular cloning, expression and characterization : Running title : Molecular cloning of ErPAL1 from cultured eucalyptus cells

Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) is the first enzyme of phenylpropanoid pathway. It produces precursors of compounds which play important roles during plant development and defense. Using genome walking technology, a PAL gene designated as ErPAL1 was cloned from Eucalyptus robusta. The full length of ErPAL1 was 3,823 bp. It consists of an intron and two exons encoding a 715 amino-acid polypeptide. Sequence alignment indicated that ErPAL1 shared 70-80% identity with the plant PAL sequences in some previous reports. We also obtained the 5'-flanking sequence and found some putative cis-acting elements such as TATA box, CAAT box, GT1-motif and G-box. ErPAL1 was expressed in Escherichia coli strain BL21 with pEcoli vector. The recombinant protein indicated PAL activity which could catalyze the deamination of L-phenylalanine into trans-cinnamic acid. The optimum temperature and pH for ErPAL1 activity was 50℃ and pH9.0, respectively. The values of Km and kcat for L-phenylalanine were 203 μM and 5.26 s(-1) each. The recombinant protein had similar biochemical properties to other plant PALs.フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)はフェニルプロパノイド経路の初発酵素である。この酵素反応により, 植物の成長過程や防御作用において重要な役割を担っていると考えられる化合物が生成されている。ユーカリ属樹木Eucalyptus robustaから, ゲノムウオーキングという手法を用いてPALゲノム遺伝子(ErPAL1)ならびにその上流配列をクローニングした。ErPAL1は全長3,823bpで1つのイントロンと2つのエクソン(715アミノ酸をコード)から成り立っており, これまでに報告されている他の植物のPAL遺伝子配列と70-80%の相同性があった。5'フランキング配列にはTATAボックス, CAATボックス, GT1モチーフやGボックスなど多くのシス因子に相当する配列が見られた。pEcoliベクターと大腸菌(BL21)システムを用いて発現させたErPAL1はPAL活性を有していた。さらにErPAL1の酵素学的特性を解析したところ, 最適温度50℃, 最適pH9.0であり, フェニルアラニンに対するKm値203μM, Kcat5.26s(-1)であった。これらの数値は他の植物から得られたPALの値と同様であった

Phylogenetic analysis of MADS-box genes in gymnosperms

被子植物においては花器官形成に関わるMADS-box遺伝子群が知られている。本研究は裸子植物における雌雄の器官形成の進化を知ることを目的とし，MADS-box遺伝子の部分配列を決定し，系統解析を行った。対象植物は，裸子植物であるイチョウ，グネツム，マオウ，ソテツ，エゾマツ，ドイツトウヒ，イチイ，スギ，メタセコイア，およびシダ植物であるヒメワラビの計10種であった。実験手法は，裸子植物（イチョウ，グネツム，トウヒ，スギ）で既に知られているMADS-box遺伝子の保存領域からデジェネレートプライマーを設計し，10種の葉から抽出したDNAをテンプレートとして計91組のプライマー対でPCRを行った。増幅されたDNA断片はクローニング後選抜し，塩基配列を決定した。その結果，イチョウ，ソテツ，エゾマツの3種において，MADS-box遺伝子の部分配列86～87塩基長がそれぞれ2，3，4種類得られた。このうちイチョウから得た2種類の配列は，既に報告されている配列（GBM21，GBM30）と一致したが，それぞれ新たに延長する配列を決定した。またソテツ，エゾマツからそれぞれ得た2種類のMADS-box配列は，機能の知られる既存のMADS-box遺伝子のホモログであることが推測された。特に今回新たに決定したソテツのMADS-box配列は，花器官の進化を探る上で今後重要な情報になると考えられる