Molecular test validations for the detection of infectious diseases agents directly from clinical samples using the automated BD MAX open mode platform

O uso da biologia molecular como ferramenta de diagnóstico microbiológico vem se expandindo no setor da medicina laboratorial. Novas plataformas aparecem com a prerrogativa de facilitar e acelerar o processo de análise. O uso de sistemas automatizados, que realizam extração, amplificação e detecção de ácidos nucleicos dentro da mesma plataforma, permite maior precisão e facilidade ao desenvolvimento de um novo teste por apresentarem todos os processos acoplados e reagentes disponíveis para o processo. Dentre as plataformas automatizadas, uma das que se destacam é o BD Max™ (Becton Dickinson Diagnostics). O sistema BD Max é uma plataforma automatizada aberta, que combina a extração de ácidos nucleicos, PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) em tempo real e detecção dentro do mesmo instrumento, oferecendo a opção de usar os testes aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) e também, testes desenvolvidos pelo usuário. Com o objetivo de testar os recursos que a modalidade aberta da plataforma BD Max oferece, foram desenvolvidos três estudos distintos para o diagnóstico molecular de agentes infecciosos direto de amostras clínicas. Estudo 1: O objetivo deste estudo foi validar um teste multiplex usando a tecnologia PCR em tempo real no sistema aberto BD MAX™, para detectar o complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT), complexo Mycobacterium avium (CMA) e Mycobacterium spp. (PAN) diretamente de amostras clínicas. Quando os resultados do novo teste foram comparados com os resultados da cultura, a reação de PCR apresentou especificidade de 97,1%, 100% e 100% para CMT, CMA e PAN, respectivamente. Estudo 2: O objetivo deste estudo foi validar um teste multiplex usando a tecnologia PCR em tempo real no sistema aberto BD MAX™ para detectar o grupo Mycobacterium abscessus (GMA), complexo Mycobacterium fortuitum (CMF) e Mycobacterium chelonae (MC), diretamente de amostras clínicas. Quando os resultados do novo teste foram comparados com os resultados da cultura, uma concordância de 97%, 100% e 99% para GMA, CMF e MC, respectivamente foi observada. Estudo 3: O objetivo deste estudo foi validar um teste multiplex usando a tecnologia PCR em tempo real no sistema aberto BD MAX™ para detectar e identificar Achromobacter xylosoxidans (AX), Burkholderia cepacia (BC), Pseudomonas aeruginosa (PSA) e Stenotrophomonas maltophilia (SM) diretamente de amostras respiratórias de pacientes portadores de Fibrose Cística (FC). Quando os resultados do novo teste foram comparados com os resultados da cultura, uma alta concordância foi observada entre as duas metodologias. Conclusão: Os 3 testes desenvolvidos provaram ser específicos e sensíveis para detectar por PCR em tempo real microrganismos causadores de infeção direto da amostra clínica. A plataforma automatizada BD Max provou ser uma excelente ferramenta para a realização de testes moleculares automatizados.The use of molecular biology as a tool for microbiology diagnostic has been expanding in the laboratory routine. Despite of the strong growth of the area, companies can not afford the demand about epidemiological changes around the world and for this reason laboratories opt to develop their own methods. New platforms appear with the prerogative to facilitate and accelerate the analysis process. The use of automated sample-in results-out platforms allows higher precision and facilitates the development of a new test by presenting all attached processes and reagents available for the test. Among platforms that best fits this profile, the BD Max™ (BD Diagnostics) is one of the most used ones. The BD Max system is an automated open platform that combines extraction and real time PCR in the same instrument, offering the option of using tests approved by the FDA or the open platform mode for userdeveloped test. In order to explore the BD Max open mode platform, three differents studies were developed to detect the microorganisms that causes infection directly from clinical samples. Study 1: A multiplex real time PCR was validated on the BD MAX™ open mode system to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), Mycobacterium avium complex (MAC) and Mycobacterium spp. (PAN) directly from clinical specimens. When compared to culture results, the new BD MAX PCR test presented specificities of 97.1%, 100% and 100% for MTC, MAC and PAN, respectively. Study 2: A multiplex real time PCR was validated on the BD MAX™ open mode system to detect Mycobacterium abscesses Group (MAG), Mycobacterium fortuitum complex (MFC) and Mycobacterium chelonae (MC) directly from clinical specimens. When compared to culture results, the new BD Max PCR test presented an overall agreement of 97%, 99% and 100% for the detection of MAG, MFC and MC, respectively. Study 3: A multiplex real time PCR was validated on the BD MAX™ open mode system to detect Achromobacter xylosoxidans (AX), Burkholderia cepacia (BC), Pseudomonas aeruginosa (PSA) and Stenotrophomonas maltophilia (SM) directly from clinical specimens collected from Cystic Fibrosis patients. When culture results were compared to the new BD Max PCR test results, a high overall agreement were observed between both methodologies. Conclusion: All 3 tests proved to be specific and sensitive to detect different microorganisms associated with infections, directly from clinical samples. The BD Max proved to be an excellent tool for automated molecular tests

Diagnosis by real-time polymerase chain reaction of pathogens and antimicrobial resistance genes in bone marrow transplant patients with bloodstream infections

Background: Early identification of pathogens and antimicrobial resistance in bloodstream infections (BSIs) decreases morbidity and mortality, particularly in immunocompromised patients. the aim of the present study was to compare real-time polymerase chain reaction (PCR) with commercial kits for detection of 17 pathogens from blood culture (BC) and 10 antimicrobial resistance genes.Methods: A total of 160 BCs were taken from bone marrow transplant patients and screened with Gram-specific probes by multiplex real-time PCR and 17 genus-specific sequences using TaqMan probes and blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB, and mecA genes by SYBR Green.Results: Twenty-three of 33 samples identified by phenotypic testing were concordantly positive by BC and real-time PCR. Pathogen identification was discordant in 13 cases. in 12 of 15 coagulase-negative staphylococci, the mecA gene was detected and four Enterococcus spp. were positive for vanA. Two blaCTX and three blaSHV genes were found by quantitative PCR. the blaKPC and metallo-beta-lactamase genes were not detected. Five fungal species were identified only by real-time PCR.Conclusions: Real-time PCR could be a valuable complementary tool in the management of BSI in bone marrow transplants patients, allowing identification of pathogens and antimicrobial resistance genes.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Universidade Federal de São Paulo, Special Clin Microbiol Lab LEMC, UNIFESP, São Paulo, BrazilFed Univ São Paulo UNIFESP, Div Infect Dis, São Paulo, BrazilGRAACC Grp Apoio Adolescente & Crianca Canc Suppo, São Paulo, BrazilFed Univ São Paulo UNIFESP, Div Hematol, São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Special Clin Microbiol Lab LEMC, UNIFESP, São Paulo, BrazilFed Univ São Paulo UNIFESP, Div Infect Dis, São Paulo, BrazilFed Univ São Paulo UNIFESP, Div Hematol, São Paulo, BrazilCNPq: 141636/2008-4Web of Scienc

Incidência de colonização retovaginal por Streptococcus agalactiae em gestantes e avaliação de cultura de swabs combinados

A identificação de fatores de risco para colonização vaginal materna por Streptococcus agalactiae tem sido objeto de estudo na literatura mundial pois essa colonização frequentemente é assintomática e pode causar bacteremia nos recémnascidos, com significante morbidade e mortalidade, especialmente em prematuros. O objetivo do estudo foi associar a colonização por S. agalactiae com o padrão da microbiota vaginal das gestantes e avaliar a eficácia de swabs combinados na detecção de S. agalactiae. Foram incluídas no estudo 405 gestantes em idade gestacional entre 35 e 37 semanas, atendidas no Pré-Natal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. Utilizando-se swabs estéreis foram obtidas amostras da região anorretal, do intróito vaginal e do terço distal da parede vaginal. O material coletado foi cultivado em caldo Todd Hewit suplementado com colistina (10g/mL) e ácido nalidíxico (15g/mL), por 18 a 24 horas à 37oC, em seguida, realizada subcultura em ágar-sangue a 5% sob as mesmas condições. As colônias sugestivas de S. agalactiae foram submetidas a coloração de Gram e ao teste da catalase e ao CAMP test. O padrão de microbiota vaginal foi avaliado empregandose a técnica de coloração de Gram. Os dados sócio-demográficos e obstétricos foram obtidos por formulário próprio. Considerando como variável resposta a colonização materna ou não por S. agalactiae, foi ajustado um modelo de regressão logística adotando o método stepwise, considerando as variáveis explanatórias quantitativas e qualitativas. Para positividade de cultura em swabs combinados e isolados foi empregado o teste de Tukey. colonização materna por S. agalactiae foi de 25,4%. Em relação à microbiota vaginal, as alterações mais freqüentes foram vaginose citolítica (11,3%) seguido de vaginose bacteriana (10,9%), candidíase (8,2%) e Flora II ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo

Real-time Polymerase Chain Reaction for Detection of Bacterial and Antimicrobial Resistance Genes in Blood Cultures of Solid Organ Transplanted Patients

Pacientes transplantados de órgãos sólidos apresentam alto risco para infecção da corrente sanguínea. A instituição da terapia antimicrobiana apropriada guiada por um diagnóstico rápido e preciso das infecções da corrente sangüínea está relacionada a um resultado satisfatório. O objetivo deste estudo foi a detecção de bactérias Grampositivas e Gram-negativas em hemocultura automatizada (Bactec®, Becton Dickinson), com a utilização do multiplex para reação da polimerase em cadeia (PCR) em Tempo Real e detecção de genes de resistência. Métodos: Um total de 185 hemoculturas, 126 positivas e 59 negativas, foram obtidos de 117 pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos, dois centros de transplante na cidade de São Paulo, Brasil, Hospital São Paulo e Hospital do Rim e Hipertensão. DNA das culturas de sangue foi extraído pelo método fenol clorofórmio (Brazol®, LGC, Brasil). A detecção do DNA bacteriano foi realizada utilizando iniciadores universais do gene 16S rRNA. A diferenciação entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas foi feito por hibridização com sondas específicas por multiplex TaqMan em Tempo Real. Os genes de resistência: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC, blaSPM, blaVIM, blaIMP, vanA, vanB e mecA foram detectadas utilizando iniciadores específicos, em Tempo Real sitema SYBR Green. A adequação do tratamento antimicrobiano foi avaliada pela revisão do prontuário dos pacientes. Resultados: Cinqüenta e nove amostras foram positivas para bactérias Gram-positivas e sessenta e sete amostras foram positivas para bactérias Gram-negativas. Todas as amostras (100%) foram concordantes entre hemocultura e PCR. Trinta e duas amostras foram positivas para o gene mecA, cinco para o gene blaCTX-M, uma para o gene blaKPC, uma para o gene blaSHV e uma para blaTEM. Oitenta e oito foram negativas para todos os genes. A detecção de genes de resistência a antimicrobianos favoreceria a adequação da antibioticoterapia, particularmente no descalonamento no tratamento de bacteremias causadas por bactérias Gram positivas e na adequação precoce no tratamento de bacteremias por bacilos Gram negativas multiresistentes em pacienetes tranplantados de órgãos sólidos. Conclusão: A PCR multiplex “in house” para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e detecção de genes de resistência aos antimicrobianos por PCR em Tempo Real poderia ser útil para o diagnóstico rápido da infecção da corrente sangüínea em pacientes submetidos a transplante de órgão sólidos.Solid organ transplanted patients are at high risk for blood stream infection. The institution of appropriate antimicrobial therapy guided by a rapid and accurate microbiological diagnosis of blood stream infections is related to a successful outcome. The aim of this study was the detection of Gram-positive and Gram-negative bacteria from automated blood cultures (Bactec®, Becton Dickinson) with the use of the multiplex real-time polymerase chain reaction (PCR) and detection of antimicrobial resistance genes. Methods: A total of 185 blood cultures, 126 positive and 59 negative, were obtained of 117 patients submitted to solid organ transplant at two transplant centers in the city of São Paulo, Brazil, Hospital São Paulo and Hospital do Rim e Hipertensão. DNA from the blood cultures was extracted by phenol chloroform method (Brazol®, LGC, Brazil). The detection of bacterial DNA was performed using universal primers of 16S rRNA gene. The differentiation between Gram-positive and Gram-negative bacteria was done by hybridization with Gram-specific probes by multiplex real-time TaqMan. The resistance genes: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC, blaSPM, blaVIM, blaIMP, vanA, vanB and mecA were detected using specific primers by real-time SYBR Green. The adequacy of antimicrobial treatment was evaluated by reviewing the records of patients. Results: Fifty nine samples were positive for Grampositive and sixty seven samples were positive for Gram-negative. All samples (100%) were concordant between blood culture and PCR. Thirty two samples were positive for mecA gene, five for blaCTX-M gene, one for blaKPC gene, one for blaSHV gene and one for blaTEM. Eighty eight were negative for all genes. The detection of antimicrobial resistance genes could enhance the appropriateness of antibiotic therapy, particularly in descalation the treatment of bacteremia caused by Gram positive and early adequacy in the treatment of Gram negative bacteremia of solid organ transplanted patients. Conclusion: The in house multiplex PCR for Grampositive/ Gram-negative bacteria and detection of antimicrobial resistance genes by Real Time PCR could be useful for rapid diagnosis of bloodstream infection in patients undergoing solid organ transplant.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP: 2008/04761-8TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe

Capsular genotype distribution of Group B Streptococcus colonization among at-risk pregnant women in Sao Paulo, Brazil.

Background: Vaccines in development against Group B Streptococcus (GBS) should contain the most prevalent capsular genotypes screened in the target population. In low- and middle-income countries epidemiological data on GBS carriage among pregnant women, a prerequisite condition for GBS neonatal sepsis, is needed to inform vaccine strategies. Objective: To investigate the prevalence of different GBS capsular genotypes that colonizes at-risk pregnant women in a private maternity hospital in São Paulo, Brazil. Methods: GBS strains isolated in routine maternity procedures from at-risk pregnant women from 2014 to 2018 were confirmed by mass spectrometry (MALDI-TOF) with subsequent DNA extraction for identification of capsular genotype through polymerase chain reaction (PCR). Demographic and gestational data were analyzed. Results: A total of 820 Todd-Hewitt broths positive for GBS were selected for streptococcal growth. Recovery and confirmation of GBS by MALDI-TOF were possible in 352. Strains were processed for determination of capsular genotype by PCR. From the total of 352 GBS isolates, 125 strains (35.5%) were genotyped as Ia; 23 (6.5%) as Ib; 41 (11.6%) as II; 36 (10.2%) as III; 4 (1.1%) as IV; 120 (34.1%) as V and 1 strain (0.3%) as VIII. Two isolates (0.7%) were not genotyped by used methodology. No statistically significant correlation between gestational risk factors, demographic data and distribution of capsular genotypes were found. Conclusions: GBS capsular genotypes Ia, Ib, II, III, and V were the most prevalent isolates colonizing at risk pregnant women in the present study. The inclusion of capsular genotypes Ia and V in the composition of future vaccines would cover 69.6% of capsular genotypes in the studied population. No statistically significant differences were observed between capsular genotype and gestational and demographic data and risk factors

Detection of Streptococcus agalactiae colonization in pregnant women by using combined swab cultures: cross-sectional prevalence study

CONTEXT AND OBJECTIVE: Maternal Streptococcus agalactiae colonization and early-onset neonatal sepsis have aroused interest in the worldwide literature. Streptococcal neonatal disease is associated with significant morbidity and mortality in the perinatal period, especially among premature neonates. The aim of this study was to assess the prevalence of maternal streptococcal colonization by using combined swab cultures, compared with swab collection from a single site. DESIGN AND SETTING: Cross-sectional study at Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. METHODS: Samples were obtained from 405 patients at gestational ages of 35 to 37 weeks. Swabs from the perianal (rectal) region, vaginal introitus and upper lateral vaginal vault were cultured in Todd-Hewitt selective broth. Colonies suggestive of Streptococcus agalactiae were subjected to the catalase and CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen) tests. To evaluate the positivity of combined swab cultures, Tukey's test was used for comparison of proportions. RESULTS: The prevalence of streptococcal colonization was 25.4%. Among the patients with positive cultures, 28.1% had this at only one collection site, 24.2% simultaneously at two sites and 47.5% at all three sites. Associating the swabs from two collection sites significantly increased streptococcal isolation, compared with a single swab (P < 0.05), except for perianal (rectal) collection. Use of combined swabs from three collection sites showed statistically higher isolation rates. CONCLUSION: In combined swab cultures collected from three collection sites, the prevalence of maternal Streptococcus agalactiae colonization was higher than in swabs collected from a single site