悪性神経膠腫におけるapoptosis誘発とBcl-2の基礎的研究

金沢大学医学部・附属病院1.細胞表層Fas抗原は細胞へapoptosisのシグナルを伝達する膜蛋白分子であるが,悪性グリオーマにおいてもその発現が報告されている。悪性グリオーマにおけるモノクローナル抗体である抗Fas抗体を用いたapoptosis誘導療法の可能性につき検討した。2.(1)C6ラットグリオーマ培養細胞の免疫組織学的検討においては,細胞膜にFas抗原の発現を認めた。(2)C6ラットグリオーマ培養細胞に抗Fas抗体(cloneCH11)100ng/mlを作用させたところ,72時間で75-95%の細胞がapoptosisをきたした。電顕とin situ nick endlabelling法での詳細な検討でも典型的なapoptosis像が観察された。(3)ラットC6脳内移植モデルを作成し,抗Fas抗体(cloneCH11)1000ng/mlを定位的に局所投与した。腫瘍内に細胞死を認めた。(4)ラット脳内(Wister Rat,6週齢)に抗Fas抗体(cloneCH11)を1000ng/ml注入し,3日目および7日目の組織を検討したが,ラットは全例生存し,特に神経学的異常はきたさず,組織学的にも大きな変化は認められなかった。(5)抗Fas抗体,抗Bcl-2抗体を使用し,ヒト剖検脳,ラット正常脳に対して免疫組織学的検討を行った。Fas抗原はラット腫瘍浸潤部のneuronやヒト照射脳のneuronの細胞膜に発現し,これらの細胞質にはBcl-2蛋白の発現も見られた。3.抗Fas抗体はC6グリオーマ細胞にapoptosisを誘導する。抗Fas抗体の脳内局所投与においてはneuronは細胞死を免れ,致死的合併症は認められなかった。bcl-2のapoptosis抑制効果の関与が考えられた。悪性グリオーマにおけるapoptosis誘導療法の可能性が広がった。研究課題/領域番号:06771068, 研究期間(年度):1994出典：研究課題「悪性神経膠腫におけるapoptosis誘発とBcl-2の基礎的研究」課題番号06771068（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-06771068/）を加工して作

ヒト下垂体中間葉およびラトケ嚢胞周囲細胞の免疫組織化学的および電顕的研究

金沢大学医学部研究課題/領域番号:01771071, 研究期間(年度):1989出典：研究課題「ヒト下垂体中間葉およびラトケ嚢胞周囲細胞の免疫組織化学的および電顕的研究」課題番号01771071（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-01771071/）を加工して作

悪性神経膠腫に対するFas/Apo-1(CD95)標的治療の基礎的研究

金沢大学医学部附属病院Fas/APO-1(CD95)はFas ligand(FasL)やFas抗体でアポトーシスを引き起こすことで知られる細胞膜受容体の一つである。以前、神経膠腫の壊死巣周囲細胞にFasが主に発現し、そのFasがアポトーシスを引き起こし、壊死巣を形成するのではないかと報告した。また、細胞死の経路構成し、抗癌剤やFas抗体、放射線で誘発されるアポトーシスにおいて誘導されるカスパーゼファミリーであるICE{interleukin-1β-converting enzyme(ICE)}やICH-1(ICE/CED-3 homologue-1)、CPP32は本研究においては極めて重要な因子である。本研究においては、神経膠腫13例に対してFasL、ICE、ICH-1およびCPP32の発現をRT-PCR、Western blot法、さらに免疫組織化学的手法を用いて、それらのmRNAと蛋白を観察した。RT-PCR法では神経膠腫全例にFasL、ICH-1、CPP32の発現がみられた。免疫染色ではFasLは神経膠芽腫全例の腫瘍細胞膜に過剰発現がみられた。このことは、もし神経膠腫がFasを発現すれば、アポトーシスが誘導できることを示唆する。ICE、ICH-1、およびCPP32の蛋白レベルの過剰発現は、神経膠腫の悪性化と共に認められた。さらに、ICH-1とCPP32の神経膠芽腫における過剰発現は、神経膠芽腫の病理学的特徴である壊死巣の形成に深く関与し、重要な機能を担うことが示唆された。Fas/APO-1 (CD95) is a cell surface receptor that mediates apoptosis when it reacts with Fas ligand (FasL) or Fas antibody. I previously reported that Fas expression in predominantly induced in perinecrotic glioma cells, suggesting that Fas induction is associated with apoptosis and necrosis formation, a histological hallmark of glioblastomas. Cysteine proteases of caspase family {interleukin-1 beta-converting enzyme (ICE)} have been implicated as components of cell death pathway and have been reported to involved in Fas, chemotherapeutic agents, and radiation-induced apoptosis. In this study, I assessed the expression lf FasL,ICE,ICE/CED-3 homologue-IL (ICH-1), and CPP32/Yama/apopain in 13 cases of primary astrocytic brain tumors (two low grade astrocytomas, five anaplastic astrocytomas, and six glioblastomas) by reverse transcription (RT) -PCR,Western blot analysis, and immunohistochemistry. RT-PCR revealed that all astrocytic brain tumors express FasL.Immunohistochemically, FasL was predominantly expressed on the plasma membrane of glioma cells. These results suggest that FasL expression is common in human astrocytic brain tumors and may cause apoptosis of glioma cells if Fas expression is induced. The frequency of ICE,ICH-1, and CPP32 overexpression appears to correlate with the malignacy grade of astrocytic brain tumors. Furthermore, ICH-1 and CPP32 overexpression may play an important role in the pathogenesis of necrosis, which is one of the histological hallmarks of glioblastoma.研究課題/領域番号:08671571, 研究期間(年度):1996 – 1997出典：研究課題「悪性神経膠腫に対するFas/Apo-1(CD95)標的治療の基礎的研究」課題番号08671571（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-08671571/086715711997kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

悪性神経膠腫におけるデスレセプターを標的とした免疫細胞療法の基礎的研究と開発

金沢大学医学部附属病院強力な抗原提示細胞である樹状細胞(DC)に腫瘍抗原を感作させ、このDCを患者頸部皮下に投与し、腫瘍特異的CD8(+)細胞障害性T細胞(CD8(+)CTL)を誘導する治療法を、悪性神経膠腫の患者に臨床応用を行い、免疫細胞療法の機序の検討をおこなった。神経膠芽腫9例、再発退形成星細胞腫1例、手術にて腫瘍摘出後に外照射を施行後、のべ50回のDC免疫細胞療法をおこなった。【結果】1)皮膚遅延型過敏性反応で陽性反応がみられた。2)パルスしたDCから誘導されたCTLは^Cr放出試験にて培養細胞に対する細胞障害活性を認めた。3)DC治療後には腫瘍細胞内にCD4(+)およびCD8(+)T細胞の浸潤を認めた。4)腫瘍浸潤CD8(+)T細胞は、FasLやTRAILには陰性であったが、granzymeBに陽性を呈した。5)2例において著明な腫瘍の縮小を認めた。6)頸部リンパ節では鼠径リンパ節に比べて、多数のCD8(+)T細胞の出現がみられた。7)PC治療群の平均生存期間は499日であった。8)全例において、DC免疫細胞療法による悪性事象の出現はみられなかった。【考察】剖検例におけるリンパ節を詳細に検討した結果、脳内免疫を司るリンパ節は、頸部リンパ節であると考えられた。誘導されたCD8陽性T細胞がgranzyme Bを用いて、標的細胞を攻撃していることを形態学的に示した。悪性グリオーマにおける腫瘍免疫は、FasLやTRAILなどが注目されていたが、免疫系でこれらのリガンドが誘導されることは少ない。今回、はじめてDC免疫細胞療法で誘導される免疫系の大部分がgranzyme Bを用いた標的細胞攻撃であることをを示した。,このことは、従来FasLやTRAILに対して、デコイ受容体を用いて、免疫系から回避してきたと考えられてきた悪性グリオーマに対して、有効な治療法となることを示唆する。Intradermal cervical vaccinations of tumor-lysate or apoptotic GB cells-pulsed dendritic cells were administered to ten patients with malignant astrocytic tumors(9 : glioblastomas, 1 : anaplastic astrocytoma).Dendritic cell vaccination elicited systemic cytotoxity in three of ten patients.A large number of intratumoral cytotoxic and helper T cell infiltration was detected in three of five patients who underwent reoperation or autopsy after vaccination. A large number of infiltrating T cells were immunoreactive for granzyme-B, and negative for Fas-ligand and TRAIL..Tumor volume was remarkably decreased in two cases after immunotherapy. Furthermore, more cytotxic T cells were detected in cervical lymph nodes than in femoral lymph nodes of four autopsy cases. The median survival times for this study and control group were 499 and 410 days, respectively. These results suggested that immunoresponse for brain tumors depends on cervical Lymph nodes and infiltrating T cells attacked target cells using with granzyme-B.研究課題/領域番号:14571303, 研究期間(年度):2002 – 2003出典：「悪性神経膠腫におけるデスレセプターを標的とした免疫細胞療法の基礎的研究と開発」研究成果報告書　課題番号14571303（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-14571303/145713032003kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作

悪性神経膠腫におけるapoptosis(自爆死)誘発と抑制因子の基礎的研究

金沢大学医学部附属病院ラットC6 glioma cell lineに対して、Fas抗体(IgM)を加え、Cell deathの形態を観察した。Fas抗体は30ng/ml,50ng/mlの濃度で培養液に添加した。コントロールと添加直後、24時間後、48時間後、72時間後、96時間後に光顕的、電顕的、ならびにin situ nick-endolabelling法で観察した。培養細胞は浮遊したものも採取し、遠沈後、光顕的には4%PFAで固定し凍結包埋した。電顕的には2%GAで前固定し、Osmiumで後固定しepon包埋した。また、ラットの脳内にmicroinjectorでFasを注入しラット脳の変化を観察した。C6培養細胞では、Fas添加24時間後から細胞縮小が始まり、72時間後には多数のearly apoptosisの所見を得た。96時間後には、apoptotic bodyが見られた。in situ nick end-labelling法ではapoptosisに陥った核に陽性反応がみられた。免疫組織化学的にC6にFasは発現していたが、Bcl-2蛋白は発現していなかった。ラット脳において、Bcl-2は神経細胞、microglia、perivascular cellに発現がみられた。Fasは神経細胞と一部のmicrogliaに見られた。Fas注入ラットは、1ヵ月生存しており、注入部分の神経細胞死はみられなっかた。以上により、Fasはラット悪性神経膠腫の培養細胞に有効であり、ラットの正常脳にはほとんど影響がなかった。また、神経細胞もFasを有しているがBcl-2を同時に有することにより、Fasによる細胞死(apoptosis)をまぬがれると考えられた。研究課題/領域番号:05771015, 研究期間(年度):1993出典：研究課題「悪性神経膠腫におけるapoptosis(自爆死)誘発と抑制因子の基礎的研究」課題番号05771015（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-05771015/）を加工して作

下垂体腫瘍における濾胞星細胞の光顕的,電顕的ならびに免疫組織学的研究

取得学位 : 博士（医学）, 学位授与番号 : 医博乙第1174号, 学位授与年月日：平成4年4月15日,学位授与年：199

培養悪性神経膠腫におけるapoptosis(プログラムされた細胞の死)の誘発

金沢大学医学部研究課題/領域番号:04770977, 研究期間(年度):1992出典：研究課題「培養悪性神経膠腫におけるapoptosis(プログラムされた細胞の死)の誘発」課題番号04770977（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-04770977/）を加工して作

Computational model of recurrent subthalamo-pallidal circuit for generation of parkinsonian oscillations

Parkinson’s disease is a movement disorder caused by dopamine depletion in the basal ganglia. Abnormally synchronized neuronal oscillations between 8 Hz and 15 Hz in the basal ganglia are implicated in motor symptoms of Parkinson’s disease. However, how these abnormal oscillations are generated and maintained in the dopamine-depleted state is unknown. Based on neural recordings in a primate model of Parkinson’s disease and other experimental and computational evidence, we hypothesized that the recurrent circuit between the subthalamic nucleus (STN) and the external segment of the globus pallidus (GPe) generates and maintains parkinsonian oscillations, and that the cortical excitatory input to the STN amplifies them. To investigate this hypothesis through computer simulations, we developed a spiking neuron model of the STN-GPe circuit by incorporating electrophysiological properties of neurons and synapses. A systematic parameter search by computer simulation identified regions in the space of the intrinsic excitability of GPe neurons and synaptic strength from the GPe to the STN that reproduce normal and parkinsonian states. In the parkinsonian state, reduced firing of GPe neurons and increased GPe-STN inhibition trigger burst activities of STN neurons with strong post-inhibitory rebound excitation, which is usually subject to short-term depression. STN neuronal bursts are shaped into the 8-15-Hz, synchronous oscillations via recurrent interactions of STN and GPe neurons. Furthermore, we show that cortical excitatory input to the STN can amplify or suppress pathological STN oscillations depending on their phase and strength, predicting conditions of cortical inputs to the STN for suppressing oscillations

TNF-α and IL-17A induce the expression of lympho-epithelial Kazal-type inhibitor in epidermal keratinocytes

BACKGROUND: Serine proteases have important roles in skin barrier function and desquamation, and the aberrant expression or the dysfunction of serine proteases is associated with the pathogenesis of skin diseases. Serine protease activities are tightly regulated by serine proteases such as kallikrein-related peptidases (KLKs) and serine protease inhibitors such as lympho-epithelial Kazal-type related inhibitor (LEKTI). For a better understating of diseases' pathogenesis, the regulation mechanism of serine proteases and the inhibitors' expression in epidermal keratinocytes must be clarified. OBJECTIVES: To investigate the effects of the cytokines on the expression of LEKTI in epidermal keratinocytes. METHODS: Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) were stimulated with panels of inflammatory cytokines. The expression of serine protease inhibitors was analyzed using quantitative real-time PCR and ELISA. LEKTI expression in normal human skin and lesions from psoriasis or atopic dermatitis (AD) were analyzed by immunohistochemically and tape-stripping. Trypsin- and chymotrypsin-like serine protease activities in culture supernatants were measured by using specific substrates. RESULTS: TNF-α and IL-17A significantly induced the expression of LEKTI in NHEKs. The immunohistochemical and tape-stripping analysis revealed that psoriatic skin lesions had higher LEKTI expression compared to normal skin and AD lesions. Trypsin- and chymotrypsin-like protease activities in the culture media were upregulated 3-5 days later but attenuated 6-7 days later period by these cytokines. CONCLUSIONS: In epidermal keratinocytes, the Th1&Th17 cytokines TNF-α and IL-17A induce the expression of serine protease inhibitor LEKTI, and it might occur to suppress the increase in the serine protease activities under inflammation

PRDM14 Drives OCT3/4 Recruitment via Active Demethylation in the Transition from Primed to Naive Pluripotency

Primordial germ cells (PGCs) are specified from epiblast cells in mice. Genes associated with naive pluripotency are repressed in the transition from inner cell mass to epiblast cells, followed by upregulation after PGC specification. However, the molecular mechanisms underlying the reactivation of pluripotency genes are poorly characterized. Here, we exploited the in vitro differentiation of epiblast-like cells (EpiLCs) from embryonic stem cells (ESCs) to elucidate the molecular and epigenetic functions of PR domain-containing 14 (PRDM14). We found that Prdm14 overexpression in EpiLCs induced their conversion to ESC-like cells even in the absence of leukemia inhibitory factor in adherent culture. This was impaired by the loss of Kruppel-like factor 2 and ten-eleven translocation (TET) proteins. Furthermore, PRDM14 recruited OCT3/4 to the enhancer regions of naive pluripotency genes via TET-base excision repair-mediated demethylation. Our results provide evidence that PRDM14 establishes a transcriptional network for naive pluripotency via active DNA demethylation