Molecular epidemiology and genetic diversity of astrovirus, bocavirus and sapovirus: study of evolutionary mechanisms

I virus sono sempre più riconosciuti i maggior responsabili di enterite sia sporadica sia epidemica con segni e sintomi clinici tali da richiedere il ricovero, specialmente nei bambini, dove la frequenza di malattia costituisce un serio problema di sanità pubblica anche sotto l'aspetto economico. Rotavirus (RV), norovirus (NoV) e adenovirus (AdV) sono riconosciuti come gli agenti eziologici più frequenti di enterite nei bambini di età inferiore ai 5 anni. Il ruolo di astrovirus (HAstV), bocavirus (HBoV) e sapovirus (SaV) in questa malattia è stato per molti anni sottostimato a causa della scarsa sensibilità delle tecniche diagnostiche di laboratorio disponibili come pure sono poco conosciute le caratteristiche genetiche dei ceppi circolanti. Scopo della ricerca condotta nel corso del dottorato di ricerca in Microbiologia e Virologia, presso l’Unità di Microbiologia e Virologia del Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale dell’Università degli Studi di Parma, è stato quello di individuare procedimenti molecolari per la rivelazione, mediante amplificazione genica, degli acidi nucleici di HAstV, HBoV e SaV dalle feci e di utilizzare i procedimenti allestiti per condurre una sorveglianza epidemiologico-molecolare dei ceppi circolanti attraverso la loro rivelazione in casi sporadici di enterite in età pediatrica, studiare la diversità genetica e indagare sui possibili meccanismi evolutivi di questi virus. I saggi di RT-PCR e PCR allestiti, una volta valutati positivamente, sono stati utilizzati per rivelare HAstV, HBoV e SaV dalle feci di bambini con enterite ricoverati od osservati ambulatorialmente presso i reparti pediatrici dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma nel periodo (gennaio 2008-giugno 2012). I risultati ottenuti hanno dimostrato che HAstV, HBoV e SaV sono rivelabili nei bambini con enterite anche con frequenze non trascurabili (2,11%, 3,09% e 2,39%, rispettivamente, in casi di infezioni singole rilevate negli anni 2008-2009) sebbene inferiori a quelle delle infezioni da RV (16,38% nel 2008 e 16,15% nel 2009) e NoV (21,6% nel 2008 e 15,9% nel 2009). I casi d’infezione sono stati osservati con maggiore frequenza nei bambini di età inferiore a 3 anni (nel 73,60% dei casi di infezione da HAstV, 82,60% dei casi di infezione da HBoV e 76,47% dei casi di infezione da SaV) e in associazione con i maggiori agenti virali di enterite nell’uomo (nel 79,16% dei casi di infezione da HAstV, 60% dei casi di infezione da HBoV e 33,33% dei casi di infezione da SaV) Inoltre le infezioni da HAstV e HBoV sembrano assumere carattere epidemico nel periodo autunno-inverno, mentre quelle da SaV sono rivelabili durante il corso di tutto l’anno. L’analisi di sequenza e filogenetica hanno dimostrato che HAstV, HBoV e SaV presentano una rilevante variabilità genetica (negli anni di studio hanno circolato 4 genotipi di HAstV e nell’ambito di questi 3 lignaggi e molteplici sublignaggi, 3 genotipi di HBoV dei quali uno comprendeva 2 lignaggi e 4 genogruppi di SaV con 3 genotipi e molteplici lignaggi) e che accumulo di mutazioni puntiformi e ricombinazione di porzioni del genoma sembrano tra i meccanismi più importanti alla base della loro evoluzione. In questo studio è stato identificato all’analisi di ORF2 un nuovo lignaggio di HAstV genotipo 2, mai descritto prima. Inoltre, lo stesso ceppo possedeva la sequenza nucleotidica di ORF1b riconducibile ad un diverso genotipo. Evidenze suggestive di eventi di ricombinazione sono emerse anche in SaV: un ceppo di genotipo GII ha dimostrato elevata identità nucleotidica (97%) e omologia filogenetica con uno dei rari ceppi ricombinanti riportati nella letteratura internazionale. Infine è anche emersa l’evidenza che tutti i tre genotipi di HBoV rivelati possono essere responsabile di enterite infantile (23 bambini con enterite abatterica presentavano HBoV quale unico agente virale nelle feci e di questi 20 (86,95%) non manifestavano alcun segno e/o sintomo clinico riconducibile ad affezione al tratto respiratorio). In conclusione, la ricerca condotta sull’epidemiologia molecolare di virus nuovi o poco noti circolanti nell’area di Parma ha consentito di avere per la prima volta in Italia un quadro epidemiologico di rilievo sull’infezione da HAstV, HBoV e SaV nella popolazione pediatrica con enterite e di dimostrare che meccanismi di drift e shift genetici sono alla base della comparsa di nuovi lignaggi e ceppi ricombinanti che possono giustificare il mantenimento o l’emergenza di taluni genotipi nella popolazione. Per definire le basi molecolari del vantaggio selettivo osservato per alcuni ceppi di HAstV, HBoV e SaV e per monitorare le loro dinamiche evolutive si rende necessaria una sorveglianza epidemiologico-molecolare più prolungata nel tempo

Temporal fluctuations of G4P[8] rotaviruses do not correlate with changes in the VP7 antigenic regions.

By monitoring the circulation of group A rotaviruses (RV) in children hospitalized with diarrhoea in Parma, Northern Italy, during 2004-2005 and 2008-2010, G1P[8] RVs were predominant, while marked fluctuations were observed for other RV strains, chiefly for G4P[8] viruses. In 2004 and 2010, G4P[8] displayed prevalence peaks (15.19% and 19.58%, respectively), whereas in 2005 and 2008 they circulated at low rate (0.1% and 2.1%, respectively). In order to gain further insights into the genetic diversity and evolution of G4P[8] RVs, 19 strains were selected for sequencing of the VP7 and VP4 genome segments. Upon molecular analyses, all the G4P[8] strains possessed a VP7 of 1C sublineage and a VP4 of P[8]-III lineage. All the strains were highly conserved in the VP7 gene, sharing a high degree of nucleotide and amino acid similarities to VP7 sequences of G4 strains detected worldwide. Conversely, two distinct P[8]-III sublineages were identified by analysing the VP8* subunit of the VP4 gene. One minor sublineage included strains detected in 2004, while the other cluster included strains detected in 2005, 2009 and 2010. The former major lineage displayed several amino acid changes (37-Pro, 85-Thr, 95-Ser and 135-Asn). Accordingly, the observed fluctuations in G4P[8] prevalence over the years did not correlate with changes in the major antigenic sites of the VP7 capsid protein, while several mutations were mapped in the hypervariable region VP8* of the VP4. The P[8] specificity is the most common type in human RVs worldwide and this antigenic type is present in both the human vaccines available in the market. A marked genetic heterogeneity has been observed within the P[8] type and this could be associated with the worldwide predominance of P[8] viruses. Whether the onset and replacement of different P[8] lineages and sublineages reflect a mechanism used by P[8] RVs to escape from the herd immunity acquired by local population raised to previous RV strains is an interesting hypothesis that fit the picture portrayed in this study and in similar investigations