SNP elemzés az rDNA ITS-5.8S-ITS2 lokuszán a mai és a középkori sárgadinnyében (Cucumis melo).

Az rDNA (riboszómális DNS) ITS (internal tanscribed spacer) szekvencielemzését végeztük el 31 mai sárgadinnyefajtában és egy régészeti feltárásból előkerült (15. sz., Budai Vár, Budapest) maglelet DNS mintájában. Hat SNP (single nucleotide polymorphism) nukleotid szubsztitúciót azonosítottunk az egyes doménekben. Az ITS elemzés alkalmasnak bizonyult a régészeti feltárásból előkerült, de endogén fertőzést hordozó magvak elkülönítésére is, ugyanis a fertőzött magokban a fajra jellemző, a 618 bp hosszúságú ITS1-5.8S-ITS2 szakaszokat magába foglaló, 664 bp hosszúságú ITS fragmentum mellett egy 580 bp nagyságú fragmentum is felszaporodott, amely – a szekvenciaelemzés és BLAST analízisben – Aspergillus nidulans eredetet mutatott (NCBI, AF455505). Az SNP szubsztitúciók gyakorisága alapján leszűkíthető volt a 15. századi minta legközelebbi fajtaköre. Az eredmények hozzájárulnak a régészeti feltárásokból előkerült ős növényfajták végső molekuláris és morfológiai rekonstrukciójához. | ITS (internal tanscribed spacer) profiles of the aDNA (ancient DNA) of seed remains extracted from an extinct sample recovered from the 15th century (Budapest, Hungary) were compared to 31 modern melon cultivars and landraces. An aseptic incubation followed by ITS analysis was used to exclude the exogenously and endogenously contaminated (Aspergillus) medieval seeds and to detect SNPs in ITS1-5.8S-ITS2 region of rDNA (ribosomal DNA). SNPs were observed at the 94–95 bp (GC to either RC, RS or AG) of ITS1; and at 414 bp (A-to-T substitution), 470 bp (T to Y or C), 610 bp (A to R or G) of ITS2. The results facilitate the final aim of molecular and morphological reconstructions of ancient melon tpyes

A köles (Panicum miliaceum) SSR- és ISSR szekvencia-stabilitása a 4. és 15. századi régészeti leletektől a mai fajtákig

A középkori (Budai Vár, 15. századi feltárás) és 4. századi (Mongólia) régészeti leletekből feltárt köles (Panicum miliaceum; 2n=4×=36) magmintákból ősDNS-t izoláltunk. A teljes genom felszaporításával (WGA – whole genome amplification) nagy mennyiségű ősDNS-t állítottunk elő. Az ősDNS szakaszok szelektív felszaporításával (AFLP – amplified fragment length polymorphism) meghatároztuk az ősDNS degradációjának mértékét, a 4. századi mintában azonosított 2 (1.2%) AFLP (MseCAA–EcoAGT) fragmentum kimutatásával (98.8% degradáció), szemben a 15. századi 158 (40%) (60% degradáció), illetve a „Topáz” mai fajtában kimutatott 264 fragmentum azonosításával (100%). Az AFLP szelektív primer-párok közül az EcoAGT–Mse-CAA volt a leghatékonyabb. Nyolc AFLP fragmentum klónozásával és szekvenálásával 2529 nt ősDNS-t azonosítottunk. Az ismétlődő DNS szakaszok közötti DNS vizsgálata során (ISSR – inter simple sequence repeats) a kilenc primerből hét primer, valamint ezek kombinációival 22 ISSR szakaszon (lokuszon) összesen 341 ISSR allélt azonosítottunk a mai fajtákban és a középkori mintában. Az allélek szekvencia adatai teljes azonosságot mutattak a mai fajtákban és a középkori mintában. A felszaporított ősDNS minták restrikciós endonukleázzal történő emésztése (CAPs – cleaved amplified polymorphic sequence) során hat enzimet alkalmaztunk (TaqI, BsuRI, HinfI, MboI, AluI és RsaI) a mitokondrium (mtDNS) 1117 bp hosszúságú 5S-18S rDNS szakaszának elemzésére. Az ALF-SSR allélek szekvencia elemzésében négy génhez kapcsolt ismétlődő DNS szakaszt elemeztünk az sh1 (shrunken1); gln4 (glutamine synthetase4); rps15 (ribosomal proteinS15); rps 28 (rps28 ribosomal protein S28) génekben, összesen 810 nt szekvencia meghatározásával. Egyetlen nukleotid-változást (SNP – single nucleotide polymorphism) mutattunk ki a 15. századi mintában az rps28 DNS szakaszban. A morfológiai fajtarekonstrukcióban a középkori minta egy ősi típusú, terpedt bugájú fajtához (Omszkoje) mutatta a legközelebbi rokonságot. Eredményeink igazolják, az egyszikű köles genom rendkívüli stabilitását, összevetve az azonos korból feltárt kétszikű sárgadinnye genomban végbement nagymértékű mikroevolúciós változásokkal. | Seed remains of medieval millet, recovered from a 15th century layer (King’s Palace, Budapest, Hungary), showed reddish yellow grain color after rehydrating on tissue culture medium that was close to grain color of modern cultivar Omszkoje. aDNA of medieval c. millet was extracted successfully, analyzed and compared to modern common millets by ISSR, SSR, CAPS and mtDNA. Analyses of fragments and sequences revealed polymorphism at seven ISSR loci (22 alleles) and at the 5S-18S rDNA locus of mtDNA. CAPS analysis of the 5S-18S rDNA fragment revealed no SNPs in the restriction sites of six endonucleases TaqI, BsuRI, HinfI, MboI, AluI and RsaI. Sequence alignments of the restriction fragments RsaI also revealed consensus sequence in the medieval sample compared to a modern variety. Morphological characterization of twenty common millet (Panicum miliaceum L., 2n=4×=36) cultivars and landraces revealed four distinct clusters which were apparently consistent with the grain colors of black, black and brown, red, yellow, and white. In the comparative AFLP, SSR and mtDNA analysis modern millet cv. ‘Topáz’ was used. AFLP analysis revealed that extensive DNA degradation had occurred in the 4th CENT. ancient millet resulting in only 2 (1.2%) AFLP fragments (98.8% degradation), compared to the 15th CENT. medieval millet with 158 (40%) fragments (60% degradation) and modern millet cv. ‘Topáz’ with 264 fragments (100%). Eight AFLP fragments were sequenced after reamplification and cloning. Microsatellite (SSR) analysis at the nuclear gln4, sh1, rps28 and rps15 loci of the medieval DNA revealed one SNP (single nucleotide polymorphism) at the 29th position (A to G) of rps28 locus compared to modern millet. Mitochondrial (mtDNA) fragment (MboI) amplified at the 5S-18S-rDNA locus in the medieval millet showed no molecular changes compared to modern millet. The results underline the significance of survived aDNA extraction and analysis of excavated seeds for comparative analysis and molecular reconstruction of ancient and extinct plant genotypes. An attempted phenotype reconstruction indicated that medieval common millet showed the closest morphological similarity to modern millet cultivar Omszkoje

Mikroszatellita lokuszok evolúciója a görögdinnyében (Citrullus lanatus) a középkor óta; (CT)3 deléció a (CT)26 nSSR-ban.

Görögdinnye (Citrullus lanatus) magleletekből (13. sz., Debrecen; 15. sz. Buda; 18. sz. Pannonhalma) DNS-izolálást, molekuláris (nSSR – nuclear simple sequence repeat; cpDNS – kloroplasztisz DNS) elemzést és fenotípusos fajtarekonstrukciót végeztünk 44 mai fajtával való összehasonlításban. Az elemzésben 47 primer-párt teszteltünk, ebből 26 primer-pár bizonyult hatékonynak a mai fajtákban, amelyek közül csak 16 volt aktív a középkori mintában. Az aktív primerek alkalmazásával szekvencia elemzést végeztünk a (CT)26-30 nSSR lokuszon, és a clp-12 cpDNS lokuszon. Megállapítottuk, hogy a középkori mintában még megtalálható (CT)3 szakasz a mai fajtában már delécióval kiesett az elmúlt 600 év során. Továbbá a cpDNS trnV (Jarret et al., 1997) lokuszán (tRNS-Valin; 299 bp) két szubsztitúciót azonosítottunk (102.196 és a 102.201 nt.-ben). A (CT)26-30 nSSR lokusz (196 bp) 122-130 bp szakaszán egy további (CT)4 inverziót is azonosítottunk, amely (CT)26-30 egyszerű mikroszatellita lokuszból kialakuló (CT)17-C-(TC)3-T-(CT)5 összetett mikroszatellita születését igazolja. Vizsgálataink során egy új retrotranszpozont (Cila-1) azonosítottunk. A középkori minta fajtarekonstrukciójához elkészítettük a 44 mai fajta morfológiai dendrogramját 25 fenotípusos bélyeg alapján. | The evolution of water melon (Citrullus lanatus) microsatellites from the 15th century (Debrecen); 13th (Buda); and 18th century, (Pannonhalma) were analyzed. Microsatellite (nSSR, nuclear simple sequence repeat) and cpDNA profiles of the aDNA (ancient DNA) of seed remains were compared to modern water melon cultivars and landraces. Sixteen primer pairs were applied. Sequence analysis at the (CT)26 and cpDNA trnV loci revealed a (CT)3 and Adenin deletions, respectively, form the current water melon cultivar compared to the medieval sample. Cila-1), a new LTR retrotansposon has been described. For morphological reconstruction, a dendrogram produced by SPSS11 based on the presence versus absence of 24 phenotypic characters were also analyzed

Morfológiai diverzitás sárgadinnyében (Cucumis melo); egy középkori típus fajtarekonstrukciója

47 mai sárgadinnye tájfajta illetve fajta morfológiai diverzitás vizsgálatát végeztük el 23 fenotípusos bélyeg alapján, egy középkori lelet (15. sz. eleje) rekonstrukciójához, valamint az eltet 600 év során végbement mikroevolúciós folyamatok nyomonkövetésére. A vizsgálatok során felvételezett 47 mai sárgadinnye fajta kivétel nélkül besorolható volt az Európában elterjedt három fő terméstípusú csoportba: a cikkelyesen barázdás Kantalup (cantalupensis), a hálózatos-recés terméshéjú Retikulatusz (reticulatus), és a simahéjú Inodorusz (inodorus) csoportba. A párhuzamosan végzett molekuláris vizsgálatok, valamint az itt közölt morfológiai diagramm segítségével a középkori minta fajta-típusa meghatározható volt, amely egy inodorusz típusú, sima héjú, zöld húsú sárgadinnye lehetett, átmeneti formával a „Hógolyó” és a „Kősárga” tájfajta között. | Morphological diversity of melon (Cucumis melo); phenotype reconstruction of a medieval sample. Morphological diversity among 47 melon (Cucumis melo) cultivars and landraces from Hungarian germplasm collection (ABI, Tápiószele) were analyzed with an ultimate aim to characterize morphologically cv. Hógolyó, which showed the closest genetic similarity to a medieval melon recovered from the 15th century. Cultivars based on fruit morphology were grouped into the three main types of melon as reticulatus, cantalupensis and inodorus. Cluster analysis (by SPSS-11) based on 23 morphological (quantitative and qualitative) traits recorded revealed an extreme diversity among accessions, nevertheless cultivars were clustered into main melon clusters with only two exceptions of inodorus type cv. Zimovka J. and Afghanistan. Cultivars Sweet ananas and Ezüst ananász; and two Hungarian landraces Kisteleki and Nagycserkeszi showed close similarity. Cultivars Hógolyó and Túrkeve of inodorus type were also grouped in one cluster, which provide insight into the morphological reconstruction of the medieval melon recovered from the 15th century. These results also indicate that old Hungarian landraces could be re-introduced into breeding programs for broadening genetic base of melon

Gene up-regulation by DNA demethylation in 35S-gshI-transgenic poplars (Populus x canescens)

Gene expression levels of transgene 35S-gshI (γ-glutamylcysteine synthetase) cloned from E. coli, and the endogenous gene gsh1 of poplar (Populus x canescens) were upregulated by the DNA demethylating agent DHAC (5,6-dihydro-5'-azacytidine hydrochloride) (10-4 M for 7 days) in aseptic leaf discs cultures. Two 35S-gshI-transgenic (6lgl and 11ggs) and wild type (WT) poplar clones were used. The efficiency of gene upregulation was also analyzed under herbicide paraquat stress (4 x 10-7 M). Levels of gshI-mRNA and gsh1-mRNA were determined by RT-qPCR (reverse transcriptase quantitative PCR) after cDNA synthesis. For internal control, the constitutively expressed housekeeping poplar genes α-tubulin and actin were used, and the 2−HHCt method was applied for data analysis. In long term DHAC treatment (21 days), a morphogenetic response of de novo root development was observed on leaf discs in a wide concentration range of DHAC (10-8 to 10-6 M). Adventitious shoots (11ggs clone) also emerged from leaf discs after a combined treatment with DHAC (10-4 M) and paraquat (10-7 M). Shoots were dissected, rooted and transplanted in glass houses for further analyses for phytoremediation capacity. Since DNA methylation patterns are inherited (epigenetic memory), these poplar plants with increased gene expression levels of both transgene 35S-gshI and endogenous gene gsh1 provide novel plant sources for in situ application

Evidence for a fluorescence yield change driven by a light-induced conformational change within photosystem II during the fast chlorophyll a fluorescence rise

AbstractExperiments were carried out to identify a process co-determining with QA the fluorescence rise between F0 and FM. With 3-(3′,4′-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea (DCMU), the fluorescence rise is sigmoidal, in its absence it is not. Lowering the temperature to −10°C the sigmoidicity is lost. It is shown that the sigmoidicity is due to the kinetic overlap between the reduction kinetics of QA and a second process; an overlap that disappears at low temperature because the temperature dependences of the two processes differ. This second process can still relax at −60°C where recombination between QA− and the donor side of photosystem (PS) II is blocked. This suggests that it is not a redox reaction but a conformational change can explain the data. Without DCMU, a reduced photosynthetic electron transport chain (ETC) is a pre-condition for reaching the FM. About 40% of the variable fluorescence relaxes in 100ms. Re-induction while the ETC is still reduced takes a few ms and this is a photochemical process. The fact that the process can relax and be re-induced in the absence of changes in the redox state of the plastoquinone (PQ) pool implies that it is unrelated to the QB-occupancy state and PQ-pool quenching. In both +/−DCMU the process studied represents ~30% of the fluorescence rise. The presented observations are best described within a conformational protein relaxation concept. In untreated leaves we assume that conformational changes are only induced when QA is reduced and relax rapidly on re-oxidation. This would explain the relationship between the fluorescence rise and the ETC-reduction

Metilviologén (paraquat) toleráns nyárfaklónok (Populus x canescens) szelekciója és alkalmazása fitoremediációban

Paraquat (syn.: metilviologén) toleráns nyárfa (Populus x canescens) klónok szelekcióját végeztük el in vitro kultúrában. A szintetikus talaj összetétele: WPM (Woody Plant Media) tápsók, 1% szacharóz, 0,8 % agar 1 mg/l benziladenin, 0,2 mg/l naftilecetsav és paraquat koncentráció sor (2×10(-6) M, 1,47×10(-6) M, 9,3×10(-7) M, 4×10(-7) M) volt. A regeneránsokat szelekciós táptalajon történő tesztelés után felszaporítottuk (mikroszaporítás), gyökeresítettük, majd üvegházban felneveltük. A molekuláris (RTqPCR) és biokémiai elemzések (aszkorbát peroxidáz, glutation peroxidáz, glutation Stranszferáz, lipoxigenáz) igazolták egy rendkívül stabil paraquat toleráns klón sikeres szelekcióját. A klónokat az in vitro vizsgálatokat követően in situ (Fűzfőgyártelep) teszteljük gyomirtószer maradványok toleranciájára. | Paraquat (syn.: methylviologen) tolerant poplar (P. x canescens) clones (PQT) were selected in in vitro cultures at concentration series of paraquat (2×10(-6) M, 1.47×10(-6) M, 9.3×10(-7) M, 4×10(-7) M). After testing on tissue culture media, regenerants were micropropagated. After rooting, PQT-clones were transplanted to a greenhouse. PQT clones showed significantly higher gst gene expression then wild type (WT) analyzed by RT-qPCR (quantitative reverse transcriptase PCR). For functional analysis enzyme activities of GST (glutathione S-transferase), APOX (ascorbate peroxides), GR (glutathione reductase), and LOX (lipoxygenase, pH 8.0) were determined. After rooting, PQT-clones were transplanted in glass houses, followed by field performance analyses for phytoremediation (environmental clean up using plants) capacity in heavily contaminated area at Balatonfűzfő, Hungar

A gst gén DNS-demetilált overexpressziója a szürkenyár (Populus x canescens) fitoremediációs kapacitásának növelésére

A szürkenyár (Populus x canescens) gst (glutation S-transzferáz) génexpresszióját növeltük meg DHAC-indukált (5,6-dihidro-5'-azacitidin hidroklorid) DNSdemetilációval. Három klónt vizsgáltunk, a természetes (WT) és két glutationtúltermelő 35S-gshI nyárfaklónt (11ggs, 6lgl) RT-qPCR elemzésben. A gst gén megemelt expressziós szintje a DHAC-kezelt kontroll növényekben 4,9-szeresre emelkedett, amely tovább nőtt paraquat stresszben (11,2-szeres), amely eredmény azt bizonyítja, hogy a DNS demetilációjával az endogén gének expressziós szintje nagyságrendekkel emelhető meg. Ismert, hogy a DNS demetiláció a vegetativ klónokban öröklődik (epigenetikus memória), ezért a demetilációs eljárás (gén upreguláció) új lehetőséget ad stressztűrő nyárfaklónok előállítására. | In the study presented gst (glutathione S-transferase) gene expression levels of poplar (Populus x canescens) were analyzed in response to the DNA demethylating agent DHAC (5,6-dihydro-5'-azacytidine hydrochloride). Aseptic leaf discs cultures of wild type (WT) and two gshI-transgenic clones (6lgl and 11ggs) clones were analyzed by RT-qPCR. High expression levels of DHAC treated control plants (4.9-fold increment, and a further 11.2-fold increment after paraquat treatment) proves that DNA demethylation provides powerful tools in gene-upregulation. As DNA methylation patterns are inherited (‘epigenetic memory’) novel poplar plant sources are provided with increased gst gene expression levels