Telomeráz enzim biológiai funkciójának vizsgálata, egy új, potens, kémiailag módosított oligonukleotid telomeráz inhibítorral tumor sejtekben = Study of the biological function of telomerase enzyme with a new, chemically modified oligonucleotide telomerase inhibitor in tumor cells

Jelen projekt során kifejlesztettünk egy sorozat új oligonukleotid szerkezetű telomeráz inhibitort (IC50 kevesebb mint 50 nmol) melyek egy kémiailag módosított szakaszból [(s4dU)n], és egy a telomeráz RNS ellen tervezett antiszensz szakaszból állnak (kiméra oligonukleotidok). Bizonyítottuk, hogy ezek az inhibitorok kölcsönhatásba lépnek telomeráz protein és RNS alegységével is. Megszintetizáltuk az egyik inhibitor Cy5 jelzett származékát és kimutattuk, hogy bejut a sejtbe. Egy új kromatográfiás módszert fejlesztettünk ki az erősen módosított és kiméra oligonukleotidok tisztítására is. A telomeráz inhibitor (X8AS) sejtkulturában aktívnak bizonyult 20-30 nap alatt ölve meg a sejteket, jó egyezésben az ideális telomeráz inhibitorokra javasolt citotoxikus hatás kinetikájával. Azt találtuk, hogy a kémiailag módosított szakasz önmagában [előnyösen az (s4dU)35]), amellett, hogy erős inhibitora a telomeráznak, a HIV replikáció potens és nem toxikus inhibitora is. Vizsgálva a gátlás mechanizmusát megállapítottuk, hogy nem a korábban kimutatott reverz transzkriptáz és telomeráz gátló aktivitás a felelős a HIV ellenes hatásért. Az (s4dU)35 a vírus sejtbe való belépését gátolja igen erősen (IC50 = 3 ng/ml). A telomeráz inhibitorok degradációs termékeinek citotoxikus hatását vizsgálva kiderült, hogy az s4dUMP és s4UMP tumor sejtkultúrában apoptózist indukál. | In this project we have developed a series of new oligonucleotide type telomerase inhibitor (IC50 less than 50 nmol) which are composed of a chemically modified moiety [(s4dU)n] and an antisense sequence designed against the telomerase RNA (chimeric oligonucleotides). Thus, the inhibitors are interacting with both the protein and the RNA subunit of the enzyme. We synthesized the Cy5-labeled derivative of an inhibitor molecule and proved that it can be taken up by the cell. We have developed a new chromatographic method for purification of the highly modified oligonucleotides including chimeric telomerase inhibitors. The telomerase inhibitor (X8AS) was active in cell culture killing the cells after 20-30 day treatment, in good agreement with the proposed mode of action for a telomerase inhibitor. It was found that the chemically modified part of the telomerase inhibitor [preferentially a (s4dU)35] beside its potent telomerase inhibiting activity, also inhibits the HIV replication. Studying the mode of action of the molecule it becomes clear that the earlier showed telomerase and reverse transcriptase inhibitory activity was not responsible for the antiviral activity. The (s4dU)35] inhibits the entry of the virus (IC50 = 3 ng/ml). We studied the citotoxic activity of the degradation products of telomerase inhibitors and found that s4dUMP and s4UMP induce apoptosis in tumor-cell culture

A harmadik szinapszis. Molekuláris kölcsönhatások az elhaló sejtek és az azokat eltávolító makrofágok, dendritikus sejtek között. = The third synapsis. Molecular interactions between dying cells and macrophages or dendritic cells.

A tudományos iskola keretében új interdiszciplináris kutatási terület megteremtésére került sor az apoptótikus sejtek és az azokat eltávolító sejtek közötti harmadi szinapszis tanulmányozására. Megállapítottuk, hogy a transzglutamináz 2 (TG2) enzim szerepet játszik az apoptotikus sejtek eltávolításában, az enzim hiányában autoimmun kórkép alakúl ki. A TG2 bejuthat a sejmagba, sejtbiokémiai hatása összefügg génkifejeződés befolyásolásával. Alzheimer kórban a TG2 résztvesz kovalensen összekötött fehérje aggregátumok létrehozásában. A TG2 védőhatást fejt ki a sejtelhalással szemben májsejtekben és szívizomsejtekben G fehérje, ill. protein diszulfid izomeráz aktivitásával. A PPAR? szerepet játszik az apoptótikus sejteket eltávolító fagocitáló képesség kialakításában fokozva fagocitózis gének kifejeződését. A PPAR?, a retinoid receptor és az LXR receptor szignál utak összekapcsolódnak a makrofágok koleszterol szintjének szabályozásában. A PPAR? aktiváció hatására a dendritikus sejekből fokozott fagocitózisra, hatékony lipid prezentációra és iNKT aktivitásra képes alpopuláció alakul. Apopto-fagocita Taqman Low Density Array-t fejleszttünkl 94 gén mennyiségi kifejeződése vizsgálatára. Az autofágiával elhaló sejtek eltávolítása szintén fagocitózissal történik, specifikus gének indukálódnak. A dendritikus sejtek kölcsönhatása apoptótikus vagy nekrotikus sejtekkel alkalmas az immunválasz finom szabályozására. | In the supported Research School a new interdisciplinary research area has been developed to study the third synapse formed between apoptotic cells and those which engolfe them. It has been established that the transglutaminase 2 (TG2) enzyme plays an important role in the clearance of apoptotic cells, the lack of this enzyme leads to autoimmune disease. TG2 can enter the nucleus and its cell biochemical effects are related to modulation of gene expression and modification of the cytoskeleton. In Alzheimer's disease TG2 participates in the formation of covalently cross-linked protein aggregates. TG2 can protect hepatocytes and cardiomyocytes against apoptosis through its G protein and protein disulphide isomerase activities. PPARγ contributes to the development of phagocytic capacity of macrophages by inducing specific phagocytic genes. The PPARγ, rretinoid and LXR receptor signal pathways are interlinked in regulating cholesterol content of cells. Activation of PPARγ in dendritic cells leads to the development of a subpopulation with increased phagocytic capacity, effective lipid presentation and iNKT activity. An apopto-phagocytic Taqman Low Density array has been developed for quantitative measuring of 94 genes in parallel. Cells dying by autophagy are removed by the same mechanism as apoptotic cells while specific phagocytic genes are induced. Dendritic cells interacting with apoptotic cells can fine tune the immune system

A telomeráz farmakológiai szabályozása: telomeráz-függő sejthalál indukciója kiméra oligonukleotidokkal illetve transz-retinsav/arzén-trioxid kombinációs kezeléssel

Immortalization is an indispensable step in oncogenesis. Most of the human malignant cells attain their immortality through stabilization of their telomere length by reactivating telomerase enzyme, a specialized reverse transcriptase. I presented in my thesis two promising approaches to target telomerase in immortal human cell lines using combinational strategies. We designed an oligonucleotide family, composed of a 13mer antisense sequence against the hTR template part and a 3' or 5' (s4dU)n moiety, possibly interacting with the catalytic protein subunit of human telomerase (hTERT), and characterized the in vitro inhibition parameters of the members. The potent and specific derivate (s4dU)8AS(PS), selected for cell culture studies could enter human cells, and caused, after a long-term treatment, death of the entire treated immortal cell population. We proved that all-trans-retinoic acid (ATRA) and arsenic trioxide (As2O3) cooperate to downregulate hTERT expression in both retinoid sensitive and resistant cell lines. hTERT repression results in a decrease of telomerase activity and leads to telomere shortening and subsequent cell death. This synergistic effect of ATRA and As2O3 could not be exclusively explained by chromatin modifications and the mechanisms of hTERT repression remain to be elucidated. Nevertheless, our findings provide direct evidence that telomerase targeting can represent a likely new mechanism by which ATRA/As2O3 therapy can exert its action in acute promyelocytic leukemia patients.Egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés; University of Debrecen, Medical and Health Science Center, Department of Biochemistry and Molecular Biology, 2005PhDBibliogr.: p. 86-10