High-dimensional NMR spectroscopy methods for the studies of disordered proteins

Jednym z problemów napotykanym w badaniach białek nieustrukturyzowanych z wykorzystaniem spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) jest istotne nakładanie się sygnałów obecnych na rejestrowanych widmach, co utrudnia ich interpretację. Problem ten naturalnie rośnie wraz ze zwiększeniem rozmiarów badanego białka, często ograniczając użyteczność wielu standardowych technik w badaniach białek o dużych rozmiarach. Proces przypisania poszczególnym jądrom atomowym ich częstości rezonansowych jest zwykle pierwszym etapem badań, koniecznym do uzyskania informacji z rozdzielczością atomową. W pracy przedstawiono dwie nowe ścieżki realizacji procesu przypisania sygnałów. Pierwsza polega na rejestracji widm projekcyjnych o sześciu i siedmiu wymiarach. Druga ścieżka dotyczyła rozwoju widm o czterech i pięciu wymiarach wykorzystujących bezpośredni transfer magnetyzacji z korzystając ze sprzężeń skalarnych przez trzy wiązania pomiędzy węglami karbonylowymi łańcucha głównego białka. Nowy schemat uzyskiwania widm projekcyjnych o sześciu i więcej wymiarach polega na jednoczesnym wykorzystaniu dwóch różnych rodzajów próbkowania niejednorodnego: radialnego oraz próbkowania losowego. W proponowanych eksperymentach cztery, próbkowane pośrednio, wymiary są realizowane poprzez próbkowanie losowe, pozostałe wymiary pośrednie są natomiast współewoluowane poprzez zastosowanie próbkowania radialnego z jednym z wymiarów próbkowanym losowo. W wyniku otrzymywane są widma pięciowymiarowe, będące projekcjami widm o sześciu lub siedmiu wymiarach. Ostatecznie otrzymuje się bezpośrednie połączenia sekwencyjne pomiędzy sygnałami obecnymi w trójwymiarowym widmie HNCO, z dodatkową możliwością uzyskania przesunięć chemicznych węgli CA. Co ważne, przetwarzanie i analiza uzyskiwanych w ten sposób widm projekcyjnych jest prowadzona analogicznie jak standardowych widm pięciowymiarowych, z wykorzystaniem tego samego oprogramowania. Zaproponowane eksperymenty o czterech i pięciu wymiarach wykorzystujące przeniesienie magnetyzacji pomiędzy węglami karbonylowymi poprzez sprzężenie skalarne przez trzy wiązania, pozwalają na uzyskanie połączeń sekwencyjnych pomiędzy trójką przesunięć chemicznych C’(i−1), N(i), H(i), a parą przesunięć C’(i±2), N(i±1). Zastosowanie dłuższych czasów mieszania prowadzi do uzyskania sygnałów korelacyjnych także do dalszych par przesunięć: C’(i±3), N(i±2), jednakże negatywnie wpływa na czułość eksperymentu. Zaproponowana koncepcja została zaimplementowana jako eksperymenty pięciowymiarowe HNCOCONH i (HACA)CON(CO)CONH. Druga z proponowanych technik, cechuje się zdecydowanie lepszymi właściwościami. Co szczególnie istotne w łatwy sposób pozwala na kontynuowanie przypisania sekwencyjnego, w przypadku gdy w sekwencji pierwszorzędowej badanego białka występują proliny (niesąsiadujące z innymi prolinami). Porównanie efektywności wszystkich proponowanych technik przedstawiłem, badając kompletność uzyskiwanych przypisań sygnałów ludzkiego białka a-synukleiny, modelowego białka nieustrukturyzowanego. W porównaniu tym została uwzględniona także możliwość rekonstrukcji uzyskanych widm algorytmem separacji sygnałów. W pracy przedstawiono także wyniki realizacji przypisań sygnałów izoformy 3x ludzkiego białka Tau. Zastosowanie proponowanych technik pozwoliło na pełne przypisanie sygnałów łańcucha głównego, także w długiej części sekwencji białka bogatej w proliny, czego nie udało się uzyskać stosując standardowe techniki pięciowymiarowe. Potwierdziło to użyteczność zaproponowanych w pracy technik w zastosowaniach do trudnych przypadków.Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is the most powerful method available for studying intrinsically disordered proteins (IDPs) at atomic resolution. The high mobility of the polypeptide chain results in the exceptionally narrow ranges of chemical shifts making the resonance assignment task, a necessary prerequisite for any advanced study, difficult. The arising problems related to signal overlap are amplified in the case of NMR studies of disordered proteins of a bigger sizes. As a consequence, the signal overlap in the spectra strongly limits the possibility of standard NMR experiments to provide sufficient resolution for IDPs characterization. Thanks to the fast local dynamics of IDPs’ backbone chains transverse relaxation is rather slow, what opens the possibility of the application of multidimensional experiments as well as obtaining high resolutions in the NMR spectra due to long evolution times used which facilitate the resonance assignment. Obtaining high quality spectra is made possible due to the use of nonuniform sampling and modern spectra processing and reconstruction methods. In this thesis new high dimensional methods for the resonance assignment in the NMR spectra of disordered proteins are discussed. Presented experiments divide into two groups: exploiting radial sampling and taking use of C’–C’ tocsy transfer. First, new ideas for obtaining six and seven dimensional spectra are presented. Discussed experiments exploit two different kinds of nonuniform sampling: radial sampling and random sampling. Combination of those provide both: low signal overlap and easy access to up to seven different Larmor frequencies from a single experiment. Processing of proposed experiments is based on the processing scheme developed in the past for the five dimensional spectra. As an example seven dimensional pulse sequence HNCO(N)CACONH is presented. Six dimensional version of the experiment ensures direct sequential link between residues giving rise to signals present in the 3D HNCO spectra. Additionally, one CA chemical shift, for extended information about reside type, can be added as a seventh dimension. Measurements of human a–Synuclein protein sample experimental verification of the proposed methodology. In the second part, a family of new experiments exploiting C’–C’ tocsy magnetisation transfer is discussed. Those experiments are providing bidirectional connectivities owing to tocsy mixing through three bond scalar coupling between carbonyl carbons in the backbone of the protein resulting in the correlation of three chemical shifts: C’(i−1)N(i), H(i) with C’(i±2)N(i±1) pairs. Use of a long mixing time allows reaching even further correlations to C’(i±3)N(i±2) pairs. Pulse sequences of two new five dimensional experiments: HNCOCONH and (HACA)CON(CO)CONH are presented. The resulting spectra have wide dynamic range, with the diagonal signals being the most intensive. In the case of nonuniformly sampled spectra such a situation is highly unfavourable as sampling artefacts arising from the diagonal peaks can hamper detection of the less intense peaks. Therefore, benefits of the application of spectra reconstruction routine were investigated. Measurements of human a–Synuclein protein sample provide experimental verification of the proposed methodology, confirming importance of spectra reconstruction. Additionally, developed methods in four dimensional version (HACA)CO(NCO)CONH and (HACACO)N(CO)CONH were applied to perform the resonance assignment of the 3x isoform of human Tau protein. The protein sequence contains 354 amino acids, including one hundred residues long proline rich fragment which full resonance assignment even using five dimensional NMR techniques was not possible. Obtained four dimensional spectra allowed full assignment of the C’, N and HN nuclei demonstrating usefulness of designed methods in this difficult case

1H, 13C and 15N resonance assignments of human BASP1

Brain acid-soluble protein 1 (BASP1, CAP-23, NAP-22) appears to be implicated in diverse cellular processes. An N-terminally myristoylated form of BASP1 has been discovered to participate in the regulation of actin cytoskeleton dynamics in neurons, whereas non-myristoylated nuclear BASP1 acts as co-suppressor of the potent transcription regulator WT1 (Wilms’ Tumor suppressor protein 1). Here we report NMR chemical shift assignment of recombinant human BASP1 fused to an N-terminal cleavable His6-tag

Structure, dynamics, and function of SrnR, a transcription factor for nickel-dependent gene expression

Streptomyces griseus, a bacterium producing antibacterial drugs and featuring possible application in phytoremediation, expresses two metal-dependent superoxide dismutase (SOD) enzymes, containing either Fe(II) or Ni(II) in their active site. In particular, the alternative expression of the two proteins occurs in a metal-dependent mode, with the Fe(II)-enzyme gene (sodF) repressed at high intracellular Ni(II) concentrations by a two-component system (TCS). This complex involves two proteins, namely SgSrnR and SgSrnQ, which represent the transcriptional regulator and the Ni(II) sensor of the system, respectively. SgSrnR belongs to the ArsR/SmtB family of metal-dependent transcription factors; in the apo-form and in the absence of SgSrnQ, it can bind the DNA operator of sodF, upregulating gene transcription. According to a recently proposed hypothesis, Ni(II) binding to SgSrnQ would promote its interaction with SgSrnR, causing the release of the complex from DNA and the consequent downregulation of the sodF expression. SgSrnQ is predicted to be highly disordered, thus the understanding, at the molecular level, of how the SgSrnR/SgSrnQ TCS specifically responds to Ni(II) requires the knowledge of the structural, dynamic, and functional features of SgSrnR. These were investigated synergistically in this work using X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, atomistic molecular dynamics calculations, isothermal titration calorimetry, and in silico molecular docking. The results reveal that the homodimeric apo-SgSrnR binds to its operator in a two-step process that involves the more rigid globular portion of the protein and leaves its largely disordered regions available to possibly interact with the disordered SgSrnQ in a Ni-dependent process

Structure and dynamics of Helicobacter pylori nickel-chaperone HypA: an integrated approach using NMR spectroscopy, functional assays and computational tools

International audienceHelicobacter pylori HypA (HpHypA) is a metallochaperone necessary for maturation of [Ni,Fe]-hydrogenase and urease, the enzymes required for colonization and survival of H. pylori in the gastric mucosa. HpHypA contains a structural Zn(II) site and a unique Ni(II) binding site at the N-terminus. X-ray absorption spectra suggested that the Zn(II) coordination depends on pH and on the presence of Ni(II). This study was performed to investigate the structural properties of HpHypA as a function of pH and Ni(II) binding, using NMR spectroscopy combined with DFT and molecular dynamics calculations. The solution structure of apo,Zn-HpHypA, containing Zn(II) but devoid of Ni(II), was determined using 2D, 3D and 4D NMR spectroscopy. The structure suggests that a Ni-binding and a Zn-binding domain, joined through a short linker, could undergo mutual reorientation. This flexibility has no physiological effect on acid viability or urease maturation in H. pylori. Atomistic molecular dynamics simulations suggest that Ni(II) binding is important for the conformational stability of the N-terminal helix. NMR chemical shift perturbation analysis indicates that no structural changes occur in the Zn-binding domain upon addition of Ni(II) in the pH 6.3-7.2 range. The structure of the Ni(II) binding site was probed using 1H NMR spectroscopy experiments tailored to reveal hyperfine-shifted signals around the paramagnetic metal ion. On this basis, two possible models were derived using quantum-mechanical DFT calculations. The results provide a comprehensive picture of the Ni(II) mode to HpHypA, important to rationalize, at the molecular level, the functional interactions of this chaperone with its protein partners