Process for enzymatic hydrolysis of starch to glucose

A process for converting starch or partially hydrolyzed starch into a syrup containing dextrose includes the steps of saccharifying starch hydrolyzate in the presence of a saccharifying starch hydrolyzate in the presence of a mutated glucoamylase or related enzyme and increasing the selectivity of the enzyme for α-(1→4)-glucosidic bonds by the glucoamylase or related enzyme by including at least one mutation, the mutation substituting an amino acid of the enzyme with at least one amino acid chosen by comparison with structurally related regions of other enzymes that selectively hydrolyze only α-(1→4) glucosidic bonds. Enzymes made in accordance with the present invention are also disclosed

Mapping of barley α-amylases and outer subsite mutants reveals dynamic high-affinity subsites and barriers in the long substrate binding cleft

AbstractSubsite affinity maps of long substrate binding clefts in barley α-amylases, obtained using a series of maltooligosaccharides of degree of polymerization of 3–12, revealed unfavorable binding energies at the internal subsites −3 and −5 and at subsites −8 and +3/+4 defining these subsites as binding barriers. Barley α-amylase 1 mutants Y105A and T212Y at subsite −6 and +4 resulted in release or anchoring of bound substrate, thus modifying the affinities of other high-affinity subsites (−2 and +2) and barriers. The double mutant Y105A-T212Y displayed a hybrid subsite affinity profile, converting barriers to binding areas. These findings highlight the dynamic binding energy distribution and the versatility of long maltooligosaccharide derivatives in mapping extended binding clefts in α-amylases

Investigation of Starch Binding Domains for Improvement of Starch degradation

Dansk resume Stivelse er planternes primære energilager og et vigtigt næringsmiddel for pattedyr,svampe og bakterier. Stivelse deponeres i højt organiserede semi-krystallinske stivelseskorn i plastider: kloroplaster i blade (transitorisk stivelse) og amyloplaster i lagerorganer som knolde. Stivelse består udelukkende af α-1,4-bundne glukose enheder, som er organiseret enten som det stort set lineære amylose molekyle eller det forgrenede amylopektin molekyle, der indeholder α-1,6-bindinger. Rod og knold stivelse er karakteriseret ved et højt niveau af kovalent bundet fosfat. Denne stivelsesbundne fosfat har en stor effekt på både stivelsens fysiske egenskaber samt på stivelsesnedbrydning i planterne. Inkludering af fosfatestre påvirker de industrielle egenskaber, og medfører forskellige meget ønskværdige egenskaber. Enzymet der kan inkorporere fosfat grupper i stivelse er en glucan, water dikinase (GWD). GWD kan fosforylere i C-3 og C-6 positionen i glukose enhederne i stivelse, ved en dikinase reaktion der anvender β-fosfat fra ATP. Mutanter i Arabidopsis thaliana GWD1 udviser en stivelses overskud fænotype med en lavere stivelses nedbrydnings rate, hvilket påviser en forbindelse mellem stivelses fosforylering og stivelses nedbrydning. To homologe proteiner er blevet identificeret i Arabidopsis genomet, navngivet AtGWD2 og AtGWD3. Mutationer i AtGWD3 resulterede også i en stivelses overskud fænotype, som set hos AtGWD1, hvilket tyder på AtGWD3 også er involveret i stivelses nedbrydning. AtGWD3 er lokaliseret i kloroplasterne og substrat analyser viste at oprenset AtGWD3 udviser præference for fosforyleret α-glucaner og katalysere udelukkende fosforylering i C-3 positionen i glukose enhederne. Disse resultater tyder på at AtGWD1 og AtGWD3 arbejder sammen i en efterfølgende fosforyleringskaskade, som er nødvendig for nedbrydning af stivelse. Glycosyl hydrolasers nedbrydning af rå stivelse er relativ ineffektiv, da polysacharrid kæderne ofte ikke er blotlagte og tilgængelige for enzymernes aktive site. Mange stivelses nedbrydende enzymer har ekstra bindings sites i det katalytiske domæne eller på separate stivelsesbindings domæner (SBD) som muliggør denne interaktion. SBDer er klassificeret i CAZy databasen i forskellige kulhydrat bindings module (CBM)familier. AtGWD1 og AtGWD2 har et tandem repeat af SBDer som tilhører familie CBM45 og AtGWD3 har et enkelt SBD fra familie CBM20. Alle er N-terminalt lokaliseret. Formålet med dette PhD projekt har været at undersøge og karakterisere GWD3-SBDs biokemiske funktion. GWD3-SBD er blevet udtrykt succesfuldt som et isoleret domæne i E. coli og oprenset. Øget stabilitet af domænet blev opnået efter yderligere aminosyrer blev inddraget i den kodende sekvens. Binding til 5 stivelseskorn var svært at måle, og det skyldes højst sandsynligt konsekvensen af den højt specialiserede rolle som GWD3 spiller i stivelses fosforyleringen. Enzymet er reguleret i kloroplasten og kun meget specialiserede områder på stivelses kornene er egnede for fosforylering i C-3 positionen og det er svært at finde forhold, hvor alle parametre er optimale. Binding til små ligosaccharider, som β-cyclodextrins (β-CD) er blevet bestemt med Surface plasmon resonance og domænet tilhører en gruppe af lav affinitets bindere, denne kategori inkluderer ikke-hydrolyserende enzymer. Den overordnede struktur fundet hos CBM20 er ifølge en homologimodellering bevaret i GWD3-SBD og bindings site 1, som er involveret i initial binding er vel bevaret både i strukturen og på sekvens niveau. Sammenlignet med andre karakteriserede CBM20, så har GWD3-SBD et mindre loop i området omkring bindings site 2. Dette loop er under substrat binding i andre CBM20 meget fleksibelt og dette kan forklare den lavere bindings kapacitet fundet hos GWD3- SBD. Fluorescens mærkning og confocal laser scanning microskopi er blevet anvendt som en metode til at visualisere SBD og hydrolyserende enzymers, f.eks. glucoamylase og α-amylases binding til stivelseskorn. Denne metode blev anvendt sammen med transient ekspression af en yellow-fluorescent protein YFP-GWD3-SBD fusion i tobaksplanter for at verificeres stivelsesbinding

Structure of the starch-debranching enzyme barley limit dextrinase reveals homology of the N-terminal domain to CBM21

Barley limit dextrinase (HvLD) is a debranching enzyme from glycoside hydrolase family 13 subfamily 13 (GH13_13) that hydrolyses α-1,6-glucosidic linkages in limit dextrins derived from amylopectin. The structure of HvLD was solved and refined to 1.9 Å resolution. The structure has a glycerol molecule in the active site and is virtually identical to the structures of HvLD in complex with the competitive inhibitors α-cyclodextrin and β-cyclodextrin solved to 2.5 and 2.1 Å resolution, respectively. However, three loops in the N-terminal domain that are shown here to resemble carbohydrate-binding module family 21 were traceable and were included in the present HvLD structure but were too flexible to be traced and included in the structures of the two HvLD–inhibitor complexes

GH62 arabinofuranosidases: Structure, function and applications

Motivated by industrial demands and ongoing scientific discoveries continuous efforts are made to identify andcreate improved biocatalysts dedicated to plant biomass conversion.α-1,2 and α-1,3 arabinofuranosyl specific α-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) are debranching enzymes catalyzing hydrolytic release of α-L-arabinofur-anosyl residues, which decorate xylan or arabinan backbones in lignocellulosic and pectin constituents of plantcell walls. The CAZy database classifies α-L-arabinofuranosidases in Glycoside Hydrolase (GH) families GH2,GH3, GH43, GH51, GH54 and GH62. Only GH62 contains exclusively α-L-arabinofuranosidases and these are offungal and bacterial origin. Twenty-two GH62 enzymes out of 223 entries in the CAZy database have beencharacterized and very recently new knowledge was acquired with regard to crystal structures, substrate spe-cificities, and phylogenetics, which overall provides novel insights into structure/function relationships of GH62.Overall GH62 α-L-arabinofuranosidases are believed to play important roles in nature by acting in synergy withseveral cell wall degrading enzymes and members of GH62 represent promising candidates for biotechnologicalimprovements of biofuel production and in various biorefinery application