Recent Progress in Research on Plant Sexual Reproduction in Arabidopsis thaliana 2003. : An Emerging Network of Plant Meiosis Genes

有性生殖を行う全ての生き物は染色体数が半減した半数体の雌性と雄性の配偶子を作り、この雌雄の配偶子が融合(受精)することによって2倍体に復帰し、次世代の細胞を生み出す。配偶子を作るのに、染色体数を半減させる作業(減数分裂)は避けて通ることはできない。ゲノムの恒常性を維持し、正常な子孫を生み出すのに減数分裂の正確性は非常に重要である。しかし、その正確性を保証する減数分裂のメカニズムの分子レベルでの研究は体細胞分裂のそれに関する詳細な研究と比べると大きな遅れをとってきた。特に植物の分野では減数分裂変異体の原因遺伝子の解析が進まず、停滞していたと言って良い。しかしモデル植物シロイヌナズナでの原因遺伝子の同定を前提とした変異体作出法が開発されて以来、胞子形成、減数分裂、あるいは配偶子形成の変異体単離とそれらの原因遺伝子の解析結果が毎年報告されるようになった。特に2003年にはシロイヌナズナから多くのこれらの減数分裂に関連する変異体が単離され、さらにその原因遺伝子の正体が明らかにされて、植物の減数分裂研究に大きな進歩が見られた。これらの遺伝子には転写調節因子、細胞周期調節因子、相同組換え関連因子、染色体構造調節タンパク質、減数分裂期染色体構成要素などの遺伝子が含まれる。このような生殖に重要な働きをする遺伝子が明らかにされつつあり、植物における生殖過程の全体像が分子のレベルで明らかにされようとしている。シロイヌナズナを用いた花器官形成以降の生殖過程の研究の近年の進歩について、特に減数分裂に関する研究に重点を置きながら、整理する。Gamete generation is prerequisite for all sexual reproductive organisms. Chromosome number of gametes have to be halved in preparation for the union (fertilization) of male and female gametes, which doubles the chromosome number of the fertilized cell. M

<原報>シロイヌナズナの花粉母細胞の減数分裂期における染色体の挙動について : 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた 3D 解析

シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の減数分裂期の花粉母細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて観察した。PI (propidium iodide)で染色された減数第一分裂前期のレプトテン期,ザイゴテン期,パキテン期,ディプロテン期,ディアキネシス期,さらに減数第一分裂中期,後期,終期,減数第二分裂前期,中期,後期,終期の染色体を観察することができた。得られたデータを3次元的に再構築することによって減数分裂時の染色体の様子を立体的に視覚化することに成功した

高等植物における細胞分裂と生理機能の制御機構の分子遺伝学的解析

生き物は成長するために細胞分裂し細胞増殖しなければならない。しかしそれも植物の場合にはその時期が適切でなければならない。移動能力のある動物の場合は受精と同時に発生を開始し、できるだけ速やかに成長することが生き残るためにもっとも大事なことといえる。しかし移動能力のない植物の場合は適切な時期に発生や成長をしなければ、枯死する運命が待ち受けている。成長に不利な時期を耐え、生き残るために、植物は発生や成長の時期を制御したり、種子を形成して休眠する。そして適当な時期が到来すると発芽し発生を開始する。生殖を行うために花を形成するのにも時期が大切である。さらに植物に特有な現象であるがセネッセンスと呼ばれる現象がある。これは環境がその植物の成長に不適切で個体を維持するのが困難であったり不利であったりする場合に、その個体の一部あるいは大部分の生理機能を低下させたり枯死させたりし、環境が回復するのを待つというものである。このように植物はその生活環の様々な場面で細胞分裂や生理機能の調節を行っている。我々は i) 種子の発芽の誘導機構、ii) 栄養成長から生殖成長への転換(花器官形成)の誘導機構、iii) 緑葉におけるセネッセンスの誘導機構の 3 つの現象に着目し分子遺伝学の手法を用いて解析を行う

<所内学術研究成果報告>T. シロイヌナズナ花粉母細胞の減数分裂時の染色体に対する FISH 法の確立

染色体を個別に追跡しその挙動を調べることのできる方法,FISH法をシロイヌナズナの花粉母細胞の減数分裂時の染色体に適用することを目的に条件検討を行った。その結果,以下の条件でFISHを行うのが最良と結論された。花序の固定はカルノイ溶液(75%エタノール,25%酢酸)を用い,室温で16時間程度行う。細胞壁とカロース層の消化は0.4%Cellulase,0.4%Pectolyase,0.4%Cytohelicase,1370U/ml β-Glucronidaseを用いて37℃で3時間処理する。スライドガラス上に消化した細胞を展開した後,再度カルノイ溶液で固定する。0.1mg/ml RNaseAで37℃30分間,0.0025%ペプシンで37℃3分間,4%パラフォルムアルデヒドで室温10分間処理した後,エタノールシリーズを通し風乾させる。ビオチン標識したプローブDNAとスライドガラス上の染色体DNAと同時に72℃3分間熱変性させた後,37℃16時間反応させハイブリッドを形成させる。洗浄後,アビジン-FITCを反応させ,ビオチン化抗アビジンDを用いて,シグナルの増幅を行う。なお,本研究においてはBACクローンF10B6よりプローブを作成し用いた

<所内学術研究成果報告>J. 赤タマネギ新品種育成のためのアグロバクテリウムを利用した形質転換法確立の試み

タマネギ植物にアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し形質転換タマネギを作成するための条件検討を行った。2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)を含むMS培地上でタマネギ種子を発芽させカルスを形成させた。これに35Sプロモーターによって制御されるGUS遺伝子を持ったpBI121あるいはアリイナーゼプロモーターによって制御されるGUS遺伝子を持ったpBIE1Eを有するアグロバクテリウムを感染させた。選抜培地上で培養した後,2-ip (N^6-2-isopentenyladenine)を含む再分化培地に移し,芽の形成を誘導した。芽の形成には至らなかったが,カルスから調製したDNA中にGUS遺伝子が存在することがGUS遺伝子を増幅するプライマーを用いたPCR法によって確かめられた。さらにGUS遺伝子産物であるβ-glucronidaseの活性を利用してGUS遺伝子の発現している細胞を組織化学的に調べたところ,pBI121を含むアグロバクテリウムで形質転換を行ったカルスでは大部分の細胞で強いGUS活性が確認された。pBIE1Eを用いた方では,pBI121の場合程強くはないがカルスの周辺部で発現が認められた。これらのことからアグロバクテリウムを介してタマネギに遺伝子を導入することが実際に可能であることが示された

Conjugated docosahexaenoic acid suppresses KPL-1 human breast cancer cell growth in vitro and in vivo: potential mechanisms of action

Introduction The present study was conducted to examine the effect of conjugated docosahexaenoic acid (CDHA) on cell growth, cell cycle progression, mode of cell death, and expression of cell cycle regulatory and/or apoptosis-related proteins in KPL-1 human breast cancer cell line. This effect of CDHA was compared with that of docosahexaenoic acid (DHA). Methods KPL-1 cell growth was assessed by colorimetric 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay; cell cycle progression and mode of cell death were examined by flow cytometry; and levels of expression of p53, p21Cip1/Waf1, cyclin D1, Bax, and Bcl-2 proteins were examined by Western blotting analysis. In vivo tumor growth was examined by injecting KPL-1 cells subcutaneously into the area of the right thoracic mammary fat pad of female athymic mice fed a CDHA diet. Results CDHA inhibited KPL-1 cells more effectively than did DHA (50% inhibitory concentration for 72 hours: 97 μmol/l and 270 μmol/l, respectively). With both CDHA and DHA growth inhibition was due to apoptosis, as indicated by the appearance of a sub-G1 fraction. The apoptosis cascade involved downregulation of Bcl-2 protein; Bax expression was unchanged. Cell cycle progression was due to G0/G1 arrest, which involved increased expression of p53 and p21Cip1/Waf1, and decreased expression of cyclin D1. CDHA modulated cell cycle regulatory proteins and apoptosis-related proteins in a manner similar to that of parent DHA. In the athymic mouse system 1.0% dietary CDHA, but not 0.2%, significantly suppressed growth of KPL-1 tumor cells; CDHA tended to decrease regional lymph node metastasis in a dose dependent manner. Conclusion CDHA inhibited growth of KPL-1 human breast cancer cells in vitro more effectively than did DHA. The mechanisms of action involved modulation of apoptosis cascade and cell cycle progression. Dietary CDHA at 1.0% suppressed KPL-1 cell growth in the athymic mouse system.</p

Analysis of Chromosome Dynamics during Meiosis I of Arabidopsis thaliana Pollen Mother Cells by Fluorescent In Situ Hybridization(FISH)

Since insertion mutagenesis methods, which enabled us to identify the mutagenized genes routinely, were developed for plants, Arabidopsis thaliana has been playing a central role in plant meiosis research. Though several techniques to analyze meiotic chromosome behavior have been introduced into Arabidopsis research since Ross et al. reported the method to observe male meiotic chromosomes of this plant through light microscope in 1996 (Chromosome Res. 4-507-516), intimate analysis of the chromosome behavior has not been accomplished. Taking advantage of the recent development of new nucleotides labeled with fluorescent dyes, we investigated chromosome behavior during male meiosis by multicolor FISH. Telomeres found around nucleoli in premeiotic interphase cells dispersed after entering meiosis, then clustered in a bouquet-like configuration. Statistically, telomeres of homologous chromosomes paired earlier than centromeres, but when respective chromosomes were examined, the telomeres were not always quick to pair. At early prophase I, possibly at around the zygotene stage, the signals from telomeres reduced to less than ten. This reduction suggests that the paired telomeres of homologous chromosomes temporally associate with other telomeres to look for their real partners. When homologous chromosomes separated at anaphase I, telomeres were always last to segregate. This suggested that there was unknown interaction between the telomeres of homologs, connecting them until anaphase I started

31st Annual Meeting and Associated Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2016) : part two

Background The immunological escape of tumors represents one of the main ob- stacles to the treatment of malignancies. The blockade of PD-1 or CTLA-4 receptors represented a milestone in the history of immunotherapy. However, immune checkpoint inhibitors seem to be effective in specific cohorts of patients. It has been proposed that their efficacy relies on the presence of an immunological response. Thus, we hypothesized that disruption of the PD-L1/PD-1 axis would synergize with our oncolytic vaccine platform PeptiCRAd. Methods We used murine B16OVA in vivo tumor models and flow cytometry analysis to investigate the immunological background. Results First, we found that high-burden B16OVA tumors were refractory to combination immunotherapy. However, with a more aggressive schedule, tumors with a lower burden were more susceptible to the combination of PeptiCRAd and PD-L1 blockade. The therapy signifi- cantly increased the median survival of mice (Fig. 7). Interestingly, the reduced growth of contralaterally injected B16F10 cells sug- gested the presence of a long lasting immunological memory also against non-targeted antigens. Concerning the functional state of tumor infiltrating lymphocytes (TILs), we found that all the immune therapies would enhance the percentage of activated (PD-1pos TIM- 3neg) T lymphocytes and reduce the amount of exhausted (PD-1pos TIM-3pos) cells compared to placebo. As expected, we found that PeptiCRAd monotherapy could increase the number of antigen spe- cific CD8+ T cells compared to other treatments. However, only the combination with PD-L1 blockade could significantly increase the ra- tio between activated and exhausted pentamer positive cells (p= 0.0058), suggesting that by disrupting the PD-1/PD-L1 axis we could decrease the amount of dysfunctional antigen specific T cells. We ob- served that the anatomical location deeply influenced the state of CD4+ and CD8+ T lymphocytes. In fact, TIM-3 expression was in- creased by 2 fold on TILs compared to splenic and lymphoid T cells. In the CD8+ compartment, the expression of PD-1 on the surface seemed to be restricted to the tumor micro-environment, while CD4 + T cells had a high expression of PD-1 also in lymphoid organs. Interestingly, we found that the levels of PD-1 were significantly higher on CD8+ T cells than on CD4+ T cells into the tumor micro- environment (p < 0.0001). Conclusions In conclusion, we demonstrated that the efficacy of immune check- point inhibitors might be strongly enhanced by their combination with cancer vaccines. PeptiCRAd was able to increase the number of antigen-specific T cells and PD-L1 blockade prevented their exhaus- tion, resulting in long-lasting immunological memory and increased median survival