Exposição embrionária ao etanol induz alterações comportamentais e neuroquímicas em Zebrafish adulto

As Desordens do Espectro Alcoólico Fetal (Fetal alcohol spectrum disorders – FASD) são um conjunto de desordens neuro-desenvolvimentais, que incluem alterações morfológicas, neuroquímicas e comportamentais. Durante a última década, o zebrafish têm se tornado um excelente modelo para analisar os efeitos, tanto a curto quanto a longo prazos, das formas severas e brandas desta desordem, incluindo possíveis alterações na morfologia cerebral, déficits comportamentais e modificações nos sistemas de neurotransmissão. O objetivo desta tese foi analisar as possíveis alterações comportamentais e neuroquímicas em zebrafish adultos expostos a diferentes concentrações de etanol durante a fase inicial do desenvolvimento. Os embriões (24 horas pós-fertilização) foram expostos, durante duas horas, a diferentes concentrações de etanol (0.1%, 0.25%, 0.5%, e 1%), mimetizando formas brandas da Síndrome alcoólica fetal. Na idade adulta, os animais foram submetidos a análises comportamentais, neuroquímicas e morfológicas. Inicialmente, os animais foram submetidos aos testes comportamentais de exploração ao Tanque novo (Novel tank test) e preferência social. Observamos que a exposição ao etanol em fases iniciais do desenvolvimento induz, de forma concentraçãodependente, uma redução no tempo gasto na zona coespecífica, próxima ao cardume, e alterações significativas na tarefa de Tanque novo (ex.: aumento do tempo no fundo do aparato), sugerindo elevada ansiedade, enquanto, o tratamento com buspirona mostrou que a redução de ansiedade está relacionada com redução no comportamento de cardume. Após, os animais foram mortos e seus cérebros removidos para análises neuroquímicas e histológicas. Os seguintes parâmetros foram avaliados: binding e captação de glutamato, imunoconteúdo de VGLUT2, atividade das enzimas glutamina-sintetase e Na+/K+ ATPase e respirometria de alta-resolução. Outro grupo de animais foi utilizado para preparação de lâminas histológicas e subsequente avaliação da neurodegeneração na região do tálamo. Quanto aos parâmetros neuroquímicos do sistema glutamatérgico, observamos redução na captação de glutamato dependente de Na+ no cérebro de zebrafish adulto, a qual pode ser modulada pelo tratamento com ceftriaxona, através do aumento da expressão do transportador EAAT2. Os grupos de maior concentração de etanol, 0,5 e 1%, apresentaram redução na ligação de glutamato em frações enriquecidas de membrana e diminuição na atividade da enzima Na+/K+ ATPase. Além disso, observamos redução da atividade da enzima glutamina-sintetase no grupo EtOH 1%. A exposição embrionária ao etanol não alterou o imunoconteúdo do transportador vesicular de glutamato VGLUT2, o metabolismo energético mitocondrial, e nem o número de neurônios do tálamo dos animais adultos. Nossos resultados confirmam que a exposição a diferentes concentrações de etanol durante o desenvolvimento leva a alterações comportamentais que persistem até a idade adulta, tais como ansiedade e diminuição da interação social. Quanto aos parâmetros neuroquímicos, a exposição embrionária ao etanol pode levar a alterações na neurotransmissão glutamatérgica no cérebro de zebrafish adulto, contudo, sem alterações nos núcleos anterior, ventrolateral e ventromedial do tálamo destes animais. Concluímos que mesmo a exposição embrionária a baixas concentrações de etanol é capaz de induzir alterações comportamentais e neuroquímicas, que persistem ao longo da vida do indivíduo.Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a wide range of ethanol-induced developmental disabilities, including craniofacial dysmorphology, neurochemical and behavioral impairments. Zebrafish has become a popular animal model to evaluate the long-lasting effects of severe and milder forms of Fetal alcohol spectrum disorders, including alterations of neurotransmission, behavior impairments and cerebral structure. Avoidance of social interaction typical of Fetal alcohol spectrum disorders may be the result of increased anxiety and could be correlated with neurochemical alterations. Glutamate is one of the most affected neurotransmitter systems in ethanol-induced developmental disabilities, including decrease of glutamate uptake on adult animal brain. This thesis proposes to assess the behavioral and neurochemical alterations in adult zebrafish after exposure to different concentrations of ethanol in the initial phase of its development. Zebrafish larvae (24 hours post-fertilization) were exposed to ethanol (0.1%, 0.25%, 0.5%, and 1%) for 2 hours, to mimic the most prevalent milder Fetal alcohol syndrome cases. In the adult age (4 - 6 months), the animals were tested in different behavioral tasks: exploration of novel apparatus tank and social interaction. After the behavior analysis, the animals were euthanized and their brains were removed. The following parameters were measured: glutamate uptake, glutamate binding, VGLUT2 immunocontent, glutamine synthetase activity, Na+/K+ ATPase activity, and high-resolution respirometry. The brains also were processed to histological sections to analyze possible modifications in the number of neurons at the thalamus. We observed an ethanol concentration dependent reduction of time spend in the conspecific zone, near the shoaling, compared to control and significant changes in the novel tank (e.g. increased bottom dwell time, increased distance to top) suggesting elevated anxiety to control, but we also found, using an anxiolytic drug buspirone, that reduction of anxiety is associated with reduced shoaling. Embryonic ethanol exposure reduced Na+-dependent glutamate uptake in the zebrafish brain. This reduction was positively modulated by ceftriaxone treatment, a beta-lactam antibiotic that promotes the expression of the glutamate transporter EAAT2. Moreover, the 0.5 % and 1% ethanol groups demonstrated reduced glutamate binding to brain membranes and decreased Na+/K+ ATPase activity in adulthood. In addition, ethanol reduced glutamine synthetase activity in the 1% EtOH group. Embryonic ethanol exposure did not alter the immunocontent of the glutamate vesicular transporter VGLUT2, the mitochondrial energetic metabolism of the brain and the number of neurons in the thalamus. Our results confirm that prior exposure to different concentrations of ethanol during the development leads to behavioral changes in adulthood, such as anxiety and decreased social interaction. Embryonic ethanol exposure may cause significant alterations in glutamatergic neurotransmission in the adult zebrafish brain, without alterations on the zebrafish anterior, ventrolateral and ventromedial thalamic nuclei. In conclusion, embryonic exposure even at low ethanol concentrations is able to impairs behavior profile and crucial aspects of brain health such as the glutamate metabolism in a long-lasting form

Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish : a detailed behavioral characterization

Pentylenetetrazole (PTZ) is a common convulsant agent used in animal models to investigate the mechanisms of seizures. Although adult zebrafish have been recently used to study epileptic seizures, a thorough characterization of the PTZinduced seizures in this animal model is missing. The goal of this study was to perform a detailed temporal behavior profile characterization of PTZ-induced seizure in adult zebrafish. The behavioral profile during 20 min of PTZ immersion (5, 7.5, 10, and 15 mM) was characterized by stages defined as scores: (0) short swim, (1) increased swimming activity and high frequency of opercular movement, (2) erratic movements, (3) circular movements, (4) clonic seizure-like behavior, (5) fall to the bottom of the tank and tonic seizure-like behavior, (6) death. Animals exposed to distinct PTZ concentrations presented different seizure profiles, intensities and latencies to reach all scores. Only animals immersed into 15 mM PTZ showed an increased time to return to the normal behavior (score 0), after exposure. Total mortality rate at 10 and 15 mM were 33% and 50%, respectively. Considering all behavioral parameters, 5, 7.5, 10, and 15 mM PTZ, induced seizures with low, intermediate, and high severity, respectively. Pretreatment with diazepam (DZP) significantly attenuated seizure severity. Finally, the brain PTZ levels in adult zebrafish immersed into the chemoconvulsant solution at 5 and 10 mM were comparable to those described for the rodent model, with a peak after a 20-min of exposure. The PTZ brain levels observed after 2.5-min PTZ exposure and after 60-min removal from exposure were similar. Altogether, our results showed a detailed temporal behavioral characterization of a PTZ epileptic seizure model in adult zebrafish. These behavioral analyses and the simple method for PTZ quantification could be considered as important tools for future investigations and translational research

Comparação comportamental do perfil convulsivo entre machos e fêmeas de zebrafish (Danio rerio) adulto induzido por ácido caínico

Epilepsia é uma desordem neurológica que afeta 3% da população mundial, com 30% de pacientes refratários. O zebrafish surge como um modelo animal para novos estudos, que buscam melhor compreender as alterações comportamentais e fisiológicas, através da utilização de drogas pró-convulsivas. Considerando que hormônios gonadais podem influenciar na refratariedade, este estudo visa analisar o perfil convulsivo e comportamental no protocolo de convulsão induzida por ácido caínico, a partir da comparação entre machos e fêmeas. Foram observadas diferenças entre gêneros no desenvolvimento e manutenção das crises convulsivas, nos índices de mortalidade e na permanência em status epilepticus. Ao avaliar um perfil de recuperação, percebeu-se que animais convulsionados mantem alterações em parâmetros de tempo e episódios de imobilidade em relação ao controle, e que em alguns casos a convulsão pode se manter por até 4 dias após a injeção, mas sem apontar diferença entre os gêneros

Comparação comportamental do perfil convulsivo entre machos e fêmeas de zebrafish (Danio rerio) adulto induzido por ácido caínico

Epilepsia é uma desordem neurológica que afeta 3% da população mundial, com 30% de pacientes refratários. O zebrafish surge como um modelo animal para novos estudos, que buscam melhor compreender as alterações comportamentais e fisiológicas, através da utilização de drogas pró-convulsivas. Considerando que hormônios gonadais podem influenciar na refratariedade, este estudo visa analisar o perfil convulsivo e comportamental no protocolo de convulsão induzida por ácido caínico, a partir da comparação entre machos e fêmeas. Foram observadas diferenças entre gêneros no desenvolvimento e manutenção das crises convulsivas, nos índices de mortalidade e na permanência em status epilepticus. Ao avaliar um perfil de recuperação, percebeu-se que animais convulsionados mantem alterações em parâmetros de tempo e episódios de imobilidade em relação ao controle, e que em alguns casos a convulsão pode se manter por até 4 dias após a injeção, mas sem apontar diferença entre os gêneros

Avaliação neuroquímica e comportamental em peixe-zebra adulto após a exposição ao etanol nos estágios iniciais do desenvolvimento

O consumo desenfreado de etanol traz consequências negativas, que envolvem problemas fisiopatológicos e de socialização do indivíduo, além de questões de saúde pública. Seu consumo por mulheres grávidas acarreta em danos ao desenvolvimento e formação cerebral do feto, causando a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF). Uma forma mais abrangente deste distúrbio é a FASD (Fetal Alcohol Spectrum Disorder), que inclui formas brandas de SAF, bem como qualquer desordem neurológica ou congênita em decorrência do etanol. O objetivo do estudo é avaliar as alterações comportamentais e neuroquímicas em peixe-zebra adulto após a exposição a diferentes concentrações de etanol na fase inicial do seu desenvolvimento. Para a indução desta desordem, utilizamos ovos de peixe-zebra com 24h pós-fertilização, expostos a diferentes concentrações de etanol: 0%, 0,1%, 0,25%, 0,5% e 1%, durante duas horas. Acompanhamos o desenvolvimento destes animais até a fase adulta (4 meses), onde foram realizadas diferentes tarefas comportamentais: exploração do aparato novel tank e interação social, além de captação de glutamato, como medida neuroquímica. Como resultados mais relevantes, destacam-se a exploração de todo o aparato pelo grupo controle e uma diminuição concentração-dependente da exploração pelos grupos expostos previamente ao etanol; maior permanência no fundo do novel tank nas concentrações elevadas de etanol; uma diminuição concentração-dependente do tempo de permanência próximo ao cardume de acordo com o aumento da concentração de etanol. Quanto às análises bioquímicas, a captação de glutamato mostrou uma diminuição significativa na função de transporte deste neurotransmissor nos animais tratados com concentrações mais elevadas de etanol. A posterior intervenção farmacológica com buspirona reverteu o perfil comportamental previamente observado pelo efeito do etanol. Considerando as análises bioquímicas, a captação de glutamato mostrou uma diminuição significativa na função de transporte deste neurotransmissor nos animais tratados com concentrações intermediárias (0.25 e 0,5%)de etanol. Concluímos que a exposição prévia a diferentes concentrações de etanol na fase embrionária leva a alterações comportamentais na fase adulta, tais como diminuição de exploração frente a novidades, ansiedade e diminuição de interação social.The excessive consumption of ethanol has negative consequences, which involve pathophysiological and individual socialization issues, and public health issues. Its consumption by pregnant women causes damage to brain development and formation of the fetus, causing fetal alcohol syndrome (FAS). A broader form of this disorder is the FASD (Fetal Alcohol Spectrum Disorder), which includes milder forms of FAS, as well as any neurological disorder or congenital due to ethanol. This project proposes to assess the behavioral and neurochemical alterations in adult zebrafish after exposure to different concentrations of ethanol in the initial phase of its development. To induce this disorder, we use zebrafish eggs and 24h post-fertilization exposed to different concentrations of ethanol, 0%, 0.1%, 0.25%, 0.5% and 1%, for two hours. We observed the development of these animals to juvenile and adulthood, which will be performed different behavioral tasks: exploration of novel apparatus tank and social interaction, as well as glutamate uptake, as measured neurochemistry. Among the most relevant results, we highlight the exploration of the whole apparatus for the control group and a concentration-dependent decrease of exploration by groups previously exposed to ethanol. It was observed high time spent in the bottom of the novel tank in high concentrations of ethanol. Furthermore, elevated spend time close to social interaction chamber was observed, with a dose-dependent decrease of this time in accordance with the increase of ethanol concentration. Further pharmacological intervention with buspirone reversed the behavioral profile previously observed the effect of ethanol. Considering biochemical analysis, glutamate uptake showed a significant decrease in the transport function of this neurotransmitter in animals treated with intermediated doses of ethanol. We conclude that prior exposure to different concentrations of ethanol in infancy leads to behavioral changes in adulthood, such as decreased operating front the news, anxiety and decreased social interaction

Exposição embrionária ao etanol induz alterações comportamentais e neuroquímicas em Zebrafish adulto

As Desordens do Espectro Alcoólico Fetal (Fetal alcohol spectrum disorders – FASD) são um conjunto de desordens neuro-desenvolvimentais, que incluem alterações morfológicas, neuroquímicas e comportamentais. Durante a última década, o zebrafish têm se tornado um excelente modelo para analisar os efeitos, tanto a curto quanto a longo prazos, das formas severas e brandas desta desordem, incluindo possíveis alterações na morfologia cerebral, déficits comportamentais e modificações nos sistemas de neurotransmissão. O objetivo desta tese foi analisar as possíveis alterações comportamentais e neuroquímicas em zebrafish adultos expostos a diferentes concentrações de etanol durante a fase inicial do desenvolvimento. Os embriões (24 horas pós-fertilização) foram expostos, durante duas horas, a diferentes concentrações de etanol (0.1%, 0.25%, 0.5%, e 1%), mimetizando formas brandas da Síndrome alcoólica fetal. Na idade adulta, os animais foram submetidos a análises comportamentais, neuroquímicas e morfológicas. Inicialmente, os animais foram submetidos aos testes comportamentais de exploração ao Tanque novo (Novel tank test) e preferência social. Observamos que a exposição ao etanol em fases iniciais do desenvolvimento induz, de forma concentraçãodependente, uma redução no tempo gasto na zona coespecífica, próxima ao cardume, e alterações significativas na tarefa de Tanque novo (ex.: aumento do tempo no fundo do aparato), sugerindo elevada ansiedade, enquanto, o tratamento com buspirona mostrou que a redução de ansiedade está relacionada com redução no comportamento de cardume. Após, os animais foram mortos e seus cérebros removidos para análises neuroquímicas e histológicas. Os seguintes parâmetros foram avaliados: binding e captação de glutamato, imunoconteúdo de VGLUT2, atividade das enzimas glutamina-sintetase e Na+/K+ ATPase e respirometria de alta-resolução. Outro grupo de animais foi utilizado para preparação de lâminas histológicas e subsequente avaliação da neurodegeneração na região do tálamo. Quanto aos parâmetros neuroquímicos do sistema glutamatérgico, observamos redução na captação de glutamato dependente de Na+ no cérebro de zebrafish adulto, a qual pode ser modulada pelo tratamento com ceftriaxona, através do aumento da expressão do transportador EAAT2. Os grupos de maior concentração de etanol, 0,5 e 1%, apresentaram redução na ligação de glutamato em frações enriquecidas de membrana e diminuição na atividade da enzima Na+/K+ ATPase. Além disso, observamos redução da atividade da enzima glutamina-sintetase no grupo EtOH 1%. A exposição embrionária ao etanol não alterou o imunoconteúdo do transportador vesicular de glutamato VGLUT2, o metabolismo energético mitocondrial, e nem o número de neurônios do tálamo dos animais adultos. Nossos resultados confirmam que a exposição a diferentes concentrações de etanol durante o desenvolvimento leva a alterações comportamentais que persistem até a idade adulta, tais como ansiedade e diminuição da interação social. Quanto aos parâmetros neuroquímicos, a exposição embrionária ao etanol pode levar a alterações na neurotransmissão glutamatérgica no cérebro de zebrafish adulto, contudo, sem alterações nos núcleos anterior, ventrolateral e ventromedial do tálamo destes animais. Concluímos que mesmo a exposição embrionária a baixas concentrações de etanol é capaz de induzir alterações comportamentais e neuroquímicas, que persistem ao longo da vida do indivíduo.Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a wide range of ethanol-induced developmental disabilities, including craniofacial dysmorphology, neurochemical and behavioral impairments. Zebrafish has become a popular animal model to evaluate the long-lasting effects of severe and milder forms of Fetal alcohol spectrum disorders, including alterations of neurotransmission, behavior impairments and cerebral structure. Avoidance of social interaction typical of Fetal alcohol spectrum disorders may be the result of increased anxiety and could be correlated with neurochemical alterations. Glutamate is one of the most affected neurotransmitter systems in ethanol-induced developmental disabilities, including decrease of glutamate uptake on adult animal brain. This thesis proposes to assess the behavioral and neurochemical alterations in adult zebrafish after exposure to different concentrations of ethanol in the initial phase of its development. Zebrafish larvae (24 hours post-fertilization) were exposed to ethanol (0.1%, 0.25%, 0.5%, and 1%) for 2 hours, to mimic the most prevalent milder Fetal alcohol syndrome cases. In the adult age (4 - 6 months), the animals were tested in different behavioral tasks: exploration of novel apparatus tank and social interaction. After the behavior analysis, the animals were euthanized and their brains were removed. The following parameters were measured: glutamate uptake, glutamate binding, VGLUT2 immunocontent, glutamine synthetase activity, Na+/K+ ATPase activity, and high-resolution respirometry. The brains also were processed to histological sections to analyze possible modifications in the number of neurons at the thalamus. We observed an ethanol concentration dependent reduction of time spend in the conspecific zone, near the shoaling, compared to control and significant changes in the novel tank (e.g. increased bottom dwell time, increased distance to top) suggesting elevated anxiety to control, but we also found, using an anxiolytic drug buspirone, that reduction of anxiety is associated with reduced shoaling. Embryonic ethanol exposure reduced Na+-dependent glutamate uptake in the zebrafish brain. This reduction was positively modulated by ceftriaxone treatment, a beta-lactam antibiotic that promotes the expression of the glutamate transporter EAAT2. Moreover, the 0.5 % and 1% ethanol groups demonstrated reduced glutamate binding to brain membranes and decreased Na+/K+ ATPase activity in adulthood. In addition, ethanol reduced glutamine synthetase activity in the 1% EtOH group. Embryonic ethanol exposure did not alter the immunocontent of the glutamate vesicular transporter VGLUT2, the mitochondrial energetic metabolism of the brain and the number of neurons in the thalamus. Our results confirm that prior exposure to different concentrations of ethanol during the development leads to behavioral changes in adulthood, such as anxiety and decreased social interaction. Embryonic ethanol exposure may cause significant alterations in glutamatergic neurotransmission in the adult zebrafish brain, without alterations on the zebrafish anterior, ventrolateral and ventromedial thalamic nuclei. In conclusion, embryonic exposure even at low ethanol concentrations is able to impairs behavior profile and crucial aspects of brain health such as the glutamate metabolism in a long-lasting form

Avaliação neuroquímica e comportamental em peixe-zebra adulto após a exposição ao etanol nos estágios iniciais do desenvolvimento

O consumo desenfreado de etanol traz consequências negativas, que envolvem problemas fisiopatológicos e de socialização do indivíduo, além de questões de saúde pública. Seu consumo por mulheres grávidas acarreta em danos ao desenvolvimento e formação cerebral do feto, causando a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF). Uma forma mais abrangente deste distúrbio é a FASD (Fetal Alcohol Spectrum Disorder), que inclui formas brandas de SAF, bem como qualquer desordem neurológica ou congênita em decorrência do etanol. O objetivo do estudo é avaliar as alterações comportamentais e neuroquímicas em peixezebra adulto após a exposição a diferentes concentrações de etanol na fase inicial do seu desenvolvimento. Para a indução desta desordem, utilizamos ovos de peixe-zebra com 24h pós-fertilização, expostos a diferentes concentrações de etanol: 0%, 0,1%, 0,25%, 0,5% e 1%, durante duas horas. Acompanhamos o desenvolvimento destes animais até a fase adulta (4 meses), onde foram realizadas diferentes tarefas comportamentais: exploração do aparato novel tank e interação social, além de captação de glutamato, como medida neuroquímica. Como resultados mais relevantes, destacam-se a exploração de todo o aparato pelo grupo controle e uma diminuição concentração-dependente da exploração pelos grupos expostos previamente ao etanol; maior permanência no fundo do novel tank nas concentrações elevadas de etanol; uma diminuição concentração-dependente do tempo de permanência próximo ao cardume de acordo com o aumento da concentração de etanol. Quanto às análises bioquímicas, a captação de glutamato mostrou uma diminuição significativa na função de transporte deste neurotransmissor nos animais tratados com concentrações mais elevadas de etanol. A posterior intervenção farmacológica com buspirona reverteu o perfil comportamental previamente observado pelo efeito do etanol. Considerando as análises bioquímicas, a captação de glutamato mostrou uma diminuição significativa na função de transporte deste neurotransmissor nos animais tratados com concentrações intermediárias (0.25 e 0,5%)de etanol. Concluímos que a exposição prévia a diferentes concentrações de etanol na fase embrionária leva a alterações comportamentais na fase adulta, tais como diminuição de exploração frente a novidades, ansiedade e diminuição de interação social.The excessive consumption of ethanol has negative consequences, which involve pathophysiological and individual socialization issues, and public health issues. Its consumption by pregnant women causes damage to brain development and formation of the fetus, causing fetal alcohol syndrome (FAS). A broader form of this disorder is the FASD (Fetal Alcohol Spectrum Disorder), which includes milder forms of FAS, as well as any neurological disorder or congenital due to ethanol. This project proposes to assess the behavioral and neurochemical alterations in adult zebrafish after exposure to different concentrations of ethanol in the initial phase of its development. To induce this disorder, we use zebrafish eggs and 24h post-fertilization exposed to different concentrations of ethanol, 0%, 0.1%, 0.25%, 0.5% and 1%, for two hours. We observed the development of these animals to juvenile and adulthood, which will be performed different behavioral tasks: exploration of novel apparatus tank and social interaction, as well as glutamate uptake, as measured neurochemistry. Among the most relevant results, we highlight the exploration of the whole apparatus for the control group and a concentration-dependent decrease of exploration by groups previously exposed to ethanol. It was observed high time spent in the bottom of the novel tank in high concentrations of ethanol. Furthermore, elevated spend time close to social interaction chamber was observed, with a dose-dependent decrease of this time in accordance with the increase of ethanol concentration. Further pharmacological intervention with buspirone reversed the behavioral profile previously observed the effect of ethanol. Considering biochemical analysis, glutamate uptake showed a significant decrease in the transport function of this neurotransmitter in animals treated with intermediated doses of ethanol. We conclude that prior exposure to different concentrations of ethanol in infancy leads to behavioral changes in adulthood, such as decreased operating front the news, anxiety and decreased social interaction