Caracterização Molecular E Bioquímica De Variantes De Oxa-50 Em Isolados De Pseudomonas Aeruginosa

ABSTRACT Along with AmpC and PIB, OXA-50 enzymes are chromosomal β-lactamases intrinsically found in Pseudomonas aeruginosa. Herein, we aimed to characterize the biochemical properties and genetic environment of OXA-50 variants from P. aeruginosa isolates. An initial β-lactamase screening demonstrated that Pb9 harbored the chromosomal encoded blaOXA-488 and ampC genes. The carbapenem-susceptible PA01 and the carbapenem-resistant P1088 (blaSPM-1+) strains, which carry blaOXA-50 and blaOXA-494, respectively, were also included in this study for comparison analysis. The genetic environments of blaOXA-50-like of Pb9 and P1088 were sequenced and compared to that of PA01. The PCR amplicons of the entire blaOXA-50-like gene were cloned into pET-26b+ vector and the recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli strain DH5α, and subsequently expressed into E. coli strain BL21 after incubation on LB agar plates containing 50 μg/mL kanamycin. The transformant strains had their β-lactam MICs determined by Etest®. Expression of OXA-50 enzymes was induced by overnight incubation in 1 L of LB broth containing 0.25 mM IPTG at 20°C. The β-lactamases were released from the periplasm by osmotic shock and purified by molecular exclusion and ion-exchange chromatography. For an initial screening, the presence of a degradation product from the hydrolysis of 10 β-lactams was evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC). Kinetics assays were performed only for the antimicrobials that showed positive hydrolysis in HPLC assay. The transcription of mexB, mexD, mexF and mexY, ampC poxA, poxB and oprD was assessed by qRT-PCR. OXA-488 and OXA-494 differ from OXA-50 in three (Gly14Ala, Thr16Ala, Arg49Leu) and two (Asp109Glu and Arg167His) amino acids, respectively. All blaOXA-50-like genes were flanked upstream by poxA and downstream by ORF coding for a hypothetical protein of 407 bp. Considering the absence of promoter-like sequences in the intergenic region, and the presence of a potential ρ-independent terminator downstream of blaOXA-50-like, we hypothesized that these genes form a two-gene operon (poxAB). Mutations in poxA were found in P1088 (Phe7Ser, Ala50Thr and Thr232IIe) and Pb9 (Phe7Ser and Asp279Ala). HPLC assay demonstrated that all OXA-50 variants were able to hydrolyze penicillin, ampicillin, oxacillin, ticarcillin e imipenem in vitro. In contrast, the MICs for carbapenems and benzylpenicillins of transformants did not differ from those observed for wild-type BL21 strain. Kinetics assays demonstrated that all enzymes present a good catalytic efficiency against benzylpenicillin and oxacillin, but not against ticarcillin. Among the OXA-50 variants, OXA-488 showed the strongest activity against imipenem. The efflux systems MexAB-OprM and MexXY-OprM were overexpressed in Pb9 (3.06 folds) and P-1088 (16.48 folds), respectively. Regarding the poxAB operon, poxB presented increased expression of ~4x and ~3x for Pb9 and P1088, respectively, but only a 1.18 e 1.13 fold change in poxA transcription was observed for those strains. Our results showed that OXA-50 enzymes can hydrolyze imipenem, but not meropenem, ticarcillin and extended-spectrum cephalosporin. In addition, the low MICs for carbapenems verified for the transformant strains demonstrated that the genetic background (poxA) of blaOXA-50-like genes could have contributed for theoverexpression of such enzymes.RESUMO As enzimas do tipo OXA-50 representam um grupo de oxacilinases cromossômicas intrínsecas de Pseudomonas aeruginosa. No presente estudo, caracterizamos as propriedades bioquímicas e moleculares de três variantes de OXA-50 isoladas de P. aeruginosa. Foram selecionadas três cepas, sendo estas: Pb9 (blaOXA-488) - cepa clínica apresentando um fenótipo raro e emergente de resistência aos carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro (ESCph); P-1088 (blaOXA-494) - primeiro isolado produtor de SPM-1; e PA01 cepa carreadora do gene blaOXA-50 original utilizada também como controle nos ensaios de qRT-PCR. O contexto genético do blaOXA-50-like da Pb9 e P-1088 foram sequenciados e comparados com a PA01. Os fragmentos gerados pela reação de PCR do gene blaOXA-50-like foram clonados no vetor pET-26b+ e os plasmídeos recombinantes foram expressos em cepas de Escherichia coli BL21 (placas de LB ágar + 50 μg/mL de canamicina). As CIMs para os clones transformantes foram determinados por Etest®. A produção da OXA-50 e de suas variantes foram induzidas em 1 L de caldo LB suplementado com 0.25 mM de IPTG e incubados durante a noite à 20°C. As β- lactamases foram liberadas do espaço periplasmático por choque osmótico e purificadas por cromatografia de exclusão molecular e troca iônica. Para a triagem inicial da hidrólise das enzimas frente aos β-lactâmicos foi realizada a cromatografia de alta eficiência (HPLC) para 10 diferentes antimicrobianos usando uma coluna C18 de 1 mL através de um gradiente linear de acetonitrila. Os ensaios cinéticos foram realizados apenas para os antimicrobianos que apresentaram hidrólise positiva no HPLC. Os níveis transcricionais dos genes mexB, mexD, mexF and mexY, ampC, poxA, poxB e oprD foram avaliados pela técnica de qRT-PCR. A OXA-488 e a OXA-494 diferem da OXA-50 em três (Gly14Ala, Thr16Ala, Arg49Leu) e dois aminoácidos (Asp109Glu and Arg167His), respectivamente. Todos os genes blaOXA-50-like avaliados eram flanqueados a montante pelo gene poxA e a jusante por uma ORF que codifica uma proteína hipotética de 407 bp. A falta de uma região promotora na região intergênica, e a presença de uma região ρ-terminadora a montante do gene blaOXA-50-like, indicam que estes genes formam um operon (poxAB). Mutações no gene poxA foram encontrados nas cepas P1088 (Phe7Ser, Ala50Thr and Thr232IIe) e Pb9 (Phe7Ser and Asp279Ala). A análise realizada por HPLC demonstrou que todas as variantes de OXA-50 foram capazes de hidrolisar benzilpenicilina, ampicilina, oxacilina, ticarcilina e imipenem. No entanto, as CIMs para benzilpenicilina e carbapenêmicos não demonstraram diferenças quando comparadas à cepa selvagem BL21 para os clones transformantes. Em concordância com os dados do HPLC, os ensaios cinéticos demonstraram boa eficiência catalítica das enzimas testadas frente à benzilpenicilina e à oxacilina. Entretanto, todas as variantes de OXA-50 avaliadas não hidrolisam ticarcilina eficientemente. Entre as variantes avaliadas, a OXA-488 demonstrou melhor atividade catalítica frente ao imipenem. Os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM estavam hiperexpressos nas cepas Pb9 (3,06 vezes) e P1088 (16,48 vezes), respetivamente. Embora aexpressão dos genes blaOXA-488 e blaOXA-494 estivesse aumentado de ~4x e ~3x em relação ao gene blaOXA-50, seus respectivos genes poxA tiveram a expressão aumentada em apenas 1,18 e 1,13 vezes. Nossos resultados demostraram que a OXA-50 e suas variantes podem hidrolisar imipenem, mas não meropenem, ticarcilina e ESCph. Além disso, as baixas CIMs para os carbapenêmicos verificadas entre os clones transformantes podem ser devido ao hospedeiro utilizado no ensaio de transformação.Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2017

Caracterização de novas β-lactamases ou variantes raras em cepas de Pseudomonas spp. no Brasil

The present study aimed to characterize and evaluate the genetic context of new β-lactamases or rare variants in Pseudomonas spp. isolates in Brazil. Initial identification was performed using the MALDI-TOF MS technique and the antimicrobial susceptibility profile was determined by broth microdilution and Etest®. All isolates were submitted to NGS using Illumina® MiSeq and Oxford® Nanopore MinION platforms. The genomic data obtained were used to analyze new resistance determinants and the genetic context in which they are inserted, as well as the virulome, and MLST. The new β-lactamases found in the study were submitted to cloning, expression, and purification steps to determine the kinetic parameters against the main β-lactams in clinical use. Five carbapenem-resistant Pseudomonas spp. isolates, previously selected from the bacterial collection of Laboratório ALERTA for carrying rare genes or undetermined mechanisms of resistance to β-lactams. Genomic analyzes revealed that the P. aeruginosa P-10.226 isolate carried the blaGES-16 gene, which was inserted in a new class I integron, called In1992 (intl1-aadB-blaOXA-56-blaGES-16- aadB-aadA6c-qacEΔ1/sul1-Δorf5), which has its 3'-CS end truncated by an NTE IS5564O presente estudo teve como objetivo caracterizar e avaliar o contexto genético de novas β-lactamases ou variantes raras em cepas de Pseudomonas spp. no Brasil. A identificação inicial dos isolados foi realizada pela técnica de MALDI-TOF MS e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi obtido pelas técnicas de microdiluição em caldo e Etest®. Todos os isolados foram submetidos ao NGS utilizando as plataformas Illumina® MiSeq e Oxford® Nanopore MinION. Os dados genômicos obtidos foram utilizados para análises de novos determinates de resistência e o contexto genético em que eles se encontram inseridos, bem como do viruloma e MLST. As novas β-lactamases encontradas no estudo foram submetidas as etapas de clonagem, expressão e purificação para a determinação dos parâmetros cinéticos frente aos principais β-lactamicos de uso clínico. Foram incluídos no estudo cinco isolados de Pseudomonas spp. resistentes aos carbapenêmicos, previamente selecionados de uma coleção do Laboratório ALERTA por carrearem genes raros ou mecanismos de resistência aos β-lactâmicos ainda desconhecidos. Análises genômicas revelaram que o isolado de P. aeruginosa P-10.226 carreava o gene blaGES-16, que estava inserido em um novo integron de classe I, denominado In1992 (intl1-aadBblaOXA-56-blaGES-16-aadB-aadA6c-qacEΔ1/sul1-Δorf5), o qual possui sua extremidade 3’-CS truncada por um NTE IS5564Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2021

Outbreak of Acinetobacter colistiniresistens bloodstream infections in a neonatal intensive care unit

This work was supported by Evandro Chagas Institute/SVS/MS.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Universidade Federal de São Paulo. Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas. Departamento de Ciências Biológicas. Laboratório de Imunologia e Bacteriologia. Setor de Biologia Molecular, Microbiologia e Imunologia. Diadema, SP, Brazil / Universidade Federal de São Paulo. Departamento de Medicina. Escola Paulista de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório Alerta. São Paulo, SP, Brazil.Universidade Federal de São Paulo. Departamento de Medicina. Escola Paulista de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório Alerta. São Paulo, SP, Brazil.Universidade Federal de São Paulo. Departamento de Medicina. Escola Paulista de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório Alerta. São Paulo, SP, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Universidade Federal de São Paulo. Departamento de Medicina. Escola Paulista de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório Alerta. São Paulo, SP, Brazil

Genomic Analysis of Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Isolates Belonging to Major Endemic Clones in South America

Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CRAB) are emerging worldwide. In South America, clinical isolates presenting such a phenotype usually do not belong to the globally distributed international clone 2 (IC2). The majority of these isolates are also resistant to multiple other antimicrobials and are often designated extremely drug-resistant (XDR). The aim of this study was to characterize the resistance mechanisms presented by 18 carbapenem-resistant A. baumannii isolates from five different Brazilian hospitals. Species identification was determined by rpoB sequencing, and antimicrobial susceptibility was determined by broth microdilution. Isolates were submitted to whole genome sequencing using Illumina platform and genetic similarity was determined by PFGE, MLST, and cgMLST. Genome analysis was used to identify intrinsic and acquired resistance determinants, including mutations in the AdeRSABC efflux system and in outer membrane proteins (OMPs). All isolates were identified as A. baumannii and grouped into 4 pulsotypes by PFGE, which belonged to clonal complexes (CC) 15(Pas)/103(Ox) (n = 4) and 79(Pas)/113(Ox) (n = 14), corresponding to IC4 and IC5, respectively. High MIC values to carbapenems, broad-spectrum cephalosporins, amikacin, and ciprofloxacin were observed in all isolates, while MICs of ampicillin/sulbactam, gentamicin, and tigecycline varied among the isolates. Minocycline was the most active antimicrobial agent tested. Moreover, 12 isolates (66.7%) were considered resistant to polymyxins. Besides intrinsic OXA-51 and ADC variants, all isolates harbored an acquired carbapenem-hydrolyzing class D beta-lactamase (CHDL) encoding gene, either bla(OXA-)(23) or bla(OXA-)(72). A diversity of aminoglycoside modifying enzymes and resistance determinants to other antimicrobial classes were found, as well as mutations in gyrA and parC. Non-synonymous mutations have also been identified in the AdeRSABC efflux system and in most OMPs, but they were considered natural polymorphisms. Moreover, resistance to polymyxins among isolates belonging to IC5 were associated to non-synonymous mutations in pmrB, but no known polymyxin resistance mechanism was identified in isolates belonging to IC4. In conclusion, A. baumannii clinical isolates belonging to South America's major clones present a myriad of antimicrobial resistance determinants. Special attention should be paid to natural polymorphisms observed in each clonal lineage, especially regarding non-synonymous mutations in constitutive genes associated with distinct resistance phenotypes

Diversity of metallo-β-lactamase-encoding genes found in distinct species of Acinetobacter isolated from the Brazilian Amazon Region

Evandro Chagas Institute, CAPES grants to APS and CSN (DS-CAPES), CNPq (grant to ACG - Process nº 305535/2014-5).Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Universidade Federal de São Paulo. Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas. Departamento de Ciências Biológicas. Setor de Biologia Molecular, Microbiologia e Imunologia. Diadema, SP, Brasil.Universidade Federal de São Paulo. Departamento de Medicina. Escola Paulista de Medicina. Laboratório Alerta. Disciplina de Infectologia. São Paulo, SP, Brasil.Universidade Federal de São Paulo. Departamento de Medicina. Escola Paulista de Medicina. Laboratório Alerta. Disciplina de Infectologia. São Paulo, SP, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Centro de Inovação Tecnológica. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Centro de Inovação Tecnológica. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Centro de Inovação Tecnológica. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Universidade Federal de São Paulo. Departamento de Medicina. Escola Paulista de Medicina. Laboratório Alerta. Disciplina de Infectologia. São Paulo, SP, Brasil.Hospital Fundação Santa Casa de Misericórdia do Pará. Belém, PA, Brasil.BACKGROUND: The multidrug resistance (MDR) phenotype is frequently observed in Acinetobacter baumannii, the most clinically relevant pathogenic species of its genus; recently, other species belonging to the A. calcoaceticus-A. baumannii complex have emerged as important MDR nosocomial pathogens. OBJECTIVES: The present study aimed to verify the occurrence of metallo-β-lactamase genes among distinct Acinetobacter species in a hospital located in the Brazilian Amazon Region. METHODS: Antimicrobial susceptibility profiles were determined by broth microdilution. The genetic relationships among these isolates were assessed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). Pyrosequencing reads of plasmids carrying the bla NDM-1 gene were generated using the Ion Torrent™ platform sequencing. FINDINGS: A total of six isolates carried bla NDM-1: A. baumannii (n = 2), A. nosocomialis (n = 3), and A. pittii (n = 1); three carried bla IMP-1: A. baumannii, A. nosocomialis, and A. bereziniae. Resistance to colistin was observed for an NDM-1-producing A. nosocomialis isolate. Diverse PFGE patterns and sequence types were found among A. nosocomialis and A. baumannii isolates. The bla NDM-1 sequence was inserted in a Tn125 transposon, while the bla IMP-1 was found as a gene cassette of the class 1 integron In86. MAIN CONCLUSIONS: To the best of our knowledge, this is the first report describing the dissemination of bla NDM-1 among distinct Acinetobacter species recovered from the same hospital in South America

Genetic and biochemical characterization of BIM-1, a novel acquired subgroup B1 MBL found in a Pseudomonas sp. strain from the Brazilian Amazon region

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for providing grants to A.P.S. and C.S.N., and to the National Council for Science and Technological Development (CNPq) for providing grants to A.V.S. and A.C.G. (process number: 312066/2019).Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde e Ambiente. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Departamento de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório ALERTA. São Paulo, SP, Brazil / Universidade Federal de São Paulo. Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas. Departamento de Ciências Biológicas. Setor de Biologia Molecular, Microbiologia e Imunologia. Laboratório de Bacteriologia e Imunologia. Diadema, SP, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde e Ambiente. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Departamento de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório ALERTA. São Paulo, SP, Brazil.Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Departamento de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório ALERTA. São Paulo, SP, Brazil.Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Departamento de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório ALERTA. São Paulo, SP, Brazil.Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Departamento de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório ALERTA. São Paulo, SP, Brazil.Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Departamento de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório ALERTA. São Paulo, SP, Brazil.Universidade de São Paulo. School of Pharmacy. Department of Clinical Analysis. São Paulo, SP, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde e Ambiente. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde e Ambiente. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil. / Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde e Ambiente. Instituto Evandro Chagas. Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia e Vigilância em Saúde. Ananindeua, PA, Brasil / Universidade Federal do Pará. Programa de Pós-Graduação em Ecologia Aquática e Pesca. Belém, PA, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde e Ambiente. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil. / Universidade Federal do Pará. Programa de Pós-Graduação em Ecologia Aquática e Pesca. Belém, PA, Brazil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde e Ambiente. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil. / Universidade Federal do Pará. Programa de Pós-Graduação em Ecologia Aquática e Pesca. Belém, PA, Brazil.Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Department of Biophysics. Laboratório de Enzimologia. São Paulo, SP, Brazil.Universidade de São Paulo. School of Pharmacy. Department of Clinical Analysis. São Paulo, SP, Brazil.Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Department of Biophysics. Laboratório de Enzimologia. São Paulo, SP, Brazil.Universidade de São Paulo. School of Pharmacy. Department of Clinical Analysis. São Paulo, SP, Brazil.Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Departamento de Medicina. Disciplina de Infectologia. Laboratório ALERTA. São Paulo, SP, Brazil.Objectives: To characterize a novel acquired MBL, BIM-1, in a Pseudomonas #2 (subgroup P. guariconensis) strain isolated from the Aurá river located in the Brazilian Amazon hydrographic basin. Methods: WGS using an Illumina® MiSeq System was used to characterize the genome of Pseudomonas sp. IEC33019 strain. Southern blotting/hybridization assays were performed to confirm the location of the MBL-encoding gene, blaBIM-1 (Belém Imipenemase). Antimicrobial susceptibility testing, cloning, and biochemical and phenotypic characterization were performed to determine BIM-1 kinetics. Results: The IEC33019 strain showed high resistance rates to β-lactams, ciprofloxacin and aminoglycosides, being susceptible only to polymyxins and susceptible, increased exposure to aztreonam. WGS analysis revealed a novel acquired MBL-encoding gene, blaBIM-1, found as a gene cassette inserted into a class 1 integron (In1326) that also carried qnrVC1 and aadA11e. In1326 was located in a complex transposon, Tn7122, carried by a 52.7 kb conjugative plasmid (pIEC33019) with a toxin/antitoxin system (vapB/vapC). BIM-1 belongs to the molecular subgroup B1 and shares 70.2% and 64.9% similarity with SIM-1 and IMP-1, respectively. Kinetics analysis of BIM-1 showed hydrolytic activity against all β-lactams tested. Conclusions: BIM-1 is a novel acquired MBL encoded by a gene carried by mobile genetic elements, which can be transferred to other Gram-negative bacilli (GNB). Because the IEC33019 strain was recovered from a river impacted by a populous metropolitan region with poor basic sanitation and served by limited potable freshwater, it would be important to establish the role of the BIM-1-producing GNB as nosocomial pathogens and/or as colonizers of the riverside population in this geographical region