Nachweis von Antibiotikaresistenzen in Rohwässern und Elimination durch Aufbereitungsverfahren

Die aquatische Umwelt kann zur Entwicklung und Verbreitung von klinisch bedeutsamen Antibiotikaresistenzgenen (ARG) beitragen. Das Potenzial der aquatischen Umwelt als Reservoir für ARG in Gebieten, die anthropogen beeinflusst sind, wurde bereits in einigen Studien beschrieben. Die Zusammenhänge zwischen dem Erwerb von Resistenzen durch Umweltbakterien und der rapiden Entwicklung multiresistenter Keime im klinischen Bereich müssen jedoch noch detaillierter aufgeschlüsselt werden, um konkrete Übertragungswege erkennen zu können und so gezielt gegen die alarmierende Entwicklung vorzugehen. Dafür wurde zum einen ein Monitoring verschiedener Bereiche in der Umwelt, wie Oberflächenwässer und Sedimente, durchgeführt. Proben chinesischer und deutscher Trinkwasser-Reservoirs weisen ähnliche Muster von Resistenzgen-Vorkommen auf, was die globale Relevanz der aquatischen Umwelt als Quelle für Antibiotikaresistenzen unterstreicht. Um Risiken durch die Verbreitung von Resistenzen durch Umweltbakterien, freie DNA oder Phagen besser abwägen zu können, wurde eine Methode entwickelt, um ARG speziell in diesen Fraktionen nachzuweisen und diese als mögliche Distributoren für ARG zu identifizieren. Für erste Oberflächenwässer, die mit diesen Methoden untersucht wurden, konnte gezeigt werden, dass Resistenzen gegen Sulfonamide (sul1 und sul2), sowie β-Laktame (blaTEM) eine Relevanz in Phagen und in frei vorliegender DNA aufweisen. Da sich mikro- und molekularbiologische Methoden stets ergänzen, wurde der Fokus sowohl auf Polymerasekettenreaktion (PCR)-basierte Methoden zum Nachweis von ARG, als auch auf kulturbasierte Verfahren zum Nachweis von Umwelt-relevanten antibiotikaresistenten Bakterien (ARB) aus Umweltproben gelegt. Durch diese auf R2A-Medien mit geringem Nährstoffgehalt basierenden Kulturverfahren konnte gezeigt werden, dass β-Laktam-Resistenzen (gegen Cephalosporine der 3. Generation und die Reserveantibiotika-Gruppe der Carbapeneme) unter oligotrophen Umweltbakterien in deutschen Oberflächenwässern bereits weit verbreitet sind. Somit konnten die Ergebnisse dieser Arbeit die Vermutung stützen, dass Umwelt-relevante Bakteriengattungen zur Verbreitung von Antibiotikaresistenzen beitragen. Da für die Entwicklung neuer Strategien zur Vermeidung der Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen meist die menschliche Gesundheit im Fokus liegt, ist auch die Elimination von ARG und ARB aus Oberflächenwässern ein entscheidender Schwerpunkt der aktuellen Forschung, um eine Gefährdung der Exposition durch Trinkwässer auszuschließen. Deshalb wurden auch im Rahmen dieser Arbeit Trinkwasseraufbereitungsanlagen beprobt und auf Antibiotikaresistenzen untersucht. Dabei standen Proben aus China und Deutschland zur Verfügung, durch die die Effizienz verschiedener Behandlungsverfahren hinsichtlich der Entfernung von Resistenzen evaluiert werden konnte. Hierbei konnten deutliche Unterschiede zwischen der ARG-Eliminationseffizienz deutscher und chinesischer Wasserwerke beobachtet werden, wobei ARG-Rückstände nach der Wasserbehandlung nur in den am Tai See (Nähe Shanghai) lokalisierten Wasserwerken feststellbar waren, was auf vergleichsweise höheren Einträgen von Abwässern aus Industrie, Agrarwirtschaft und urbanen Ballungsräumen zurückzuführen ist. Die Entwicklung und Anwendung quantitativer Long-Amplikon PCR Methoden zum Nachweis vollständiger Resistenzgene (darunter sul1 und blaTEM) konnten die Reduktion der ARG durch reaktive Behandlungsverfahren wie Chlorung, UV-Bestrahlung und Ozonung hierbei besser abbilden als die konventionellen qPCR Methoden, mit denen eine Überschätzung der Genkopienzahl wahrscheinlich ist. Innovative Layer-by-Layer-Membrantechnologien konnten zudem auf den Rückhalt von ARG untersucht werden. Ihr Potential für die Anwendung in der Trinkwasseraufbereitung konnte sowohl im Labor- als auch im Pilotmaßstab bestätigt werden

Performance of Layer-by-Layer-Modified Multibore® Ultrafiltration Capillary Membranes for Salt Retention and Removal of Antibiotic Resistance Genes

Polyether sulfone Multibore® ultrafiltration membranes were modified using polyelectrolyte multilayers via the layer-by-layer (LbL) technique in order to increase their rejection capabilities towards salts and antibiotic resistance genes. The modified capillary membranes were characterized to exhibit a molecular weight cut-off (at 90% rejection) of 384 Da. The zeta-potential at pH 7 was −40 mV. Laboratory tests using single-fiber modified membrane modules were performed to evaluate the removal of antibiotic resistance genes; the LbL-coated membranes were able to completely retain DNA fragments from 90 to 1500 nt in length. Furthermore, the pure water permeability and the retention of single inorganic salts, MgSO$_{4}$, CaCl$_{2}$ and NaCl, were measured using a mini-plant testing unit. The modified membranes had a retention of 80% toward MgSO$_{4}$ and CaCl$_{2}$ salts, and 23% in case of NaCl. The modified membranes were also found to be stable against mechanical backwashing (up to 80 LMH) and chemical regeneration (in acidic conditions and basic/oxidizing conditions)

Cascade Filtration With PCR Detection and Field-Flow-Fractionation Online With ICP-MS for the Characterization of DNA Interaction With Suspended Particulate Matter

The variety of applied antibiotics in animal and human medicine results in the release, development, and spread of relevant numbers of antibiotic resistance genes (ARGs) in the environment. The majority of ARGs are present in intracellular forms (in bacteria). Neglected aspects are extracellular variants of ARGs (eARGs) and their fragments, which have been detected in surface-water samples and sediments. The stability of eARGs is expected to be low; however, binding to particulate matter is likely to improve their stability and also affect their transport and dissemination behavior. Few studies have investigated DNA particle interactions, mostly via indirect characterization of adduct formation in model systems but not in real environmental matrices. Therefore, our study aims at a novel approach for direct characterization of desoxyribonucleic acid (DNA) particle interactions using both cascade filtration and field-flow fractionation. Cascade filtration with quantitative polymerase chain reaction (qPCR) detection indicated retention of ARGs on filters with much larger pore sizes supporting the hypothesis of ARG-particle interactions. However, artifacts from membrane clogging or DNA–membrane interaction cannot be excluded. Consequently, asymmetric flow field-flow fractionation was investigated as an alternative separation technique with the advantage of particle separation in a thin channel, reducing the risk of artifacts. The key method parameters, membrane composition, molecular weight cut off, and carrier composition, were systematically investigated using a calf-thymus DNA-spiked surface-water sample as a model. The results clearly showed a shift in the elution time of clay particles suggesting the presence of DNA–clay adducts. Multi-element detection by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) enabled monitoring of clay via the Al, Fe, and Si signals and DNA via the P signal. Matching peak profiles for the new fraction in the fractograms of the ARG and DNA-spiked water sample support adduct formation. Further evidence was provided by a novel post-channel filtration approach for the separation of free DNA from DNA–clay adducts

Performance of Layer-by-Layer-Modified Multibore® Ultrafiltration Capillary Membranes for Salt Retention and Removal of Antibiotic Resistance Genes

Polyether sulfone Multibore® ultrafiltration membranes were modified using polyelectrolyte multilayers via the layer-by-layer (LbL) technique in order to increase their rejection capabilities towards salts and antibiotic resistance genes. The modified capillary membranes were characterized to exhibit a molecular weight cut-off (at 90% rejection) of 384 Da. The zeta-potential at pH 7 was −40 mV. Laboratory tests using single-fiber modified membrane modules were performed to evaluate the removal of antibiotic resistance genes; the LbL-coated membranes were able to completely retain DNA fragments from 90 to 1500 nt in length. Furthermore, the pure water permeability and the retention of single inorganic salts, MgSO4, CaCl2 and NaCl, were measured using a mini-plant testing unit. The modified membranes had a retention of 80% toward MgSO4 and CaCl2 salts, and 23% in case of NaCl. The modified membranes were also found to be stable against mechanical backwashing (up to 80 LMH) and chemical regeneration (in acidic conditions and basic/oxidizing conditions)