Desenvolvimento de insumos para uso diagnóstico e estudo da biologia do Zika vírus (ZIKV) através da caracterização da proteína não estrutural 1 (NS1) no curso da infecção

Orientadora: Dra. Claudia Nunes Duarte dos SantosCoorientadora: Dra. Camila ZanlucaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 30/10/2023Inclui referênciasResumo: Os arbovírus (do inglês arthropod-borne virus), representam uma das principais causas de doenças infecciosas em animais e humanos e, por este motivo, causam grande impacto socioeconômico global. Sua distribuição está intimamente ligada à presença de vetores competentes, apresentando grande prevalência nas regiões tropicais e subtropicais, como é o caso do Brasil. A emergência do Zika virus (ZIKV) na Polinésia e Américas entre os anos 2013 e 2016 colocou em alerta autoridades sanitárias no mundo, devido ao seu alto potencial de dispersão geográfica e, principalmente, pelo surgimento de novas manifestações clínicas. Diferentemente de surtos anteriores, além do aumento na gravidade da doença, a infecção por ZIKV foi associada pela primeira vez com complicações neurológicas em fetos e adultos. O diagnóstico é dificultado pela baixa viremia de curta duração, assim como pela reatividade cruzada em ensaios sorológicos devido à cocirculação de orthoflavivirus filogeneticamente relacionados, como o vírus da dengue (DENV) e febre amarela (YFV). Embora a proteína não estrutural 1 (NS1) tenha sido usada como marcador de infecção aguda por DENV e para o vírus do Oeste do Nilo (WNV), pouco se sabe sobre a expressão deste antígeno durante a infecção por ZIKV. Sendo assim, neste trabalho, um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) baseado na captura de NS1 foi desenvolvido para estudar o padrão de produção e secreção deste antígeno in vitro e explorar a aplicação desta proteína como um possível marcador diagnóstico. Para isto, anticorpos monoclonais anti-NS1 foram produzidos e triados quanto a sua reatividade cruzada com outros orthoflavivirus. Os anticorpos selecionados foram produzidos em larga escala e modificados pela adição da enzima HRP. Proteínas NS1 recombinantes de ZIKV, DENV e YFV foram expressas em células S2 de Drosophila melanogaster e purificadas por cromatografia líquida de afinidade. A obtenção destes insumos possibilitou a padronização de um ELISA de captura quantitativo com limite de detecção de 19,5 ng/mL, sem reação cruzada contra os vírus YFV e DENV. Este teste foi aplicado para o estudo da dinâmica de expressão e secreção de NS1 em células C6/36, A549 e JEG-3 infectadas. Ainda que este antígeno possa ser detectado no sobrenadante de infecção, a quantificação por ELISA revelou uma maior concentração de proteína associada a células. Surpreendentemente, foi observado que nas linhagens de origem humana, a frequência de células NS1 positivas se mantém alta mesmo com uma queda significativa na infecção ao longo do tempo. Experimentos adicionais são necessários para determinar se este fenótipo é exclusivo de ZIKV ou também pode ser observado para outros orthoflavivirus. Embora mais testes com amostras humanas devam ser conduzidos para validar a aplicabilidade da detecção de NS1 para diagnóstico, os insumos produzidos neste estudo são promissores para a detecção específica de ZIKV, podendo eventualmente ser utilizados em outros ensaios diagnósticos, como imunofluorescência, imunohistoquímica e teste imunocromatográfico para aplicação point of care.Abstract: Arthropod-borne viruses (arboviruses) represent one of the leading causes of human and animal infectious disease, resulting in considerable social and economic impact globally. Their distribution is intrinsically connected to the presence of competent vectors, presenting high prevalence in tropical and subtropical regions, which is the case for Brazil. Zika virus (ZIKV) emergence in Polynesia and the Americas from 2013 to 2016 raised concerns mainly due to reports of new clinical manifestations as well as its high potential for geographic spread. In addition to heightened disease severity, ZIKV infection was associated with neurological complications in fetuses and adults for the first time. Diagnostic accuracy is undermined by the short-term low viremia as well as cross-reactivity in serological assays due to the cocirculation of closely related orthoflaviviruses, such as dengue virus (DENV) and yellow fever virus (YFV). While the non-structural protein 1 (NS1) has been used as an early marker of DENV and West Nile virus (WNV) infection, little is known about ZIKV NS1 expression. In the present work, a NS1 capture enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) was developed to study in vitro synthesis and secretion patterns of this antigen and assess the application of this protein as a potential diagnostic marker. Monoclonal antibodies raised against NS1 were screened for their cross-reactivity to other orthoflaviviruses. Selected antibodies were produced on large scale and modified by the addition of the HRP enzyme. Recombinant NS1 proteins of ZIKV, DENV, and YFV were expressed in S2 Drosophila melanogaster cells and purified by affinity liquid chromatography. These reagents were used to develop a quantitative antigen capture ELISA with a limit of detection of 19.5 ng/mL and no crossreactivity to YFV, and DENV. NS1 expression and secretion dynamics in infected C6/36, A549, and JEG-3 cells were assessed with this assay. While detectable in culture supernatants, higher concentrations of this protein were predominantly cellassociated. Surprisingly, it was observed that in human cell lines, the frequency of NS1-positive cells remained high despite a significant reduction in infection over time. Additional experiments are necessary to determine if this phenotype is exclusive to ZIKV or can also be observed for other orthoflaviviruses. Although further testing with human samples is needed to validate the applicability of NS1 detection for diagnosis, the tools developed in this work are promising for specific detection of ZIKV and could be used for other diagnostic assays, such as immunofluorescence, immunohistochemistry, and an immunochromatographic test for point of care application

A lectina bacteriana sMTL-13 regula a morte celular e produção de fator de necrose tumoral em macrófagos durante a infecção por Mycobacterium tuberculosis

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014.A infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) pode levar a um estado latente no qual o hospedeiro é capaz de controlar o crescimento do patógeno. Embora uma resposta imune celular seja fundamental para o controle de Mtb dentro de macrófagos, foi demonstrado que fatores associados à micobactéria apresentam um papel importante no desenlace da infecção. Levando em consideração o alto impacto na saúde mundial causado pela tuberculose (TB), a ineficiência de vacinas e o surgimento de cepas de Mtb resistentes, há uma necessidade do desenvolvimento de novas estratégias para diagnósticos, tratamentos e vacinas contra TB. O nosso grupo descreveu previamente uma nova lectina de 13 kDa secretada pelo M. tuberculosis (sMTL-13) e embora tenha sido sugerida a importância desta proteína em pacientes com tuberculose, ainda restam questões fundamentais da biologia desta lectina que precisam ser elucidadas. Para investigar o possível papel da sMTL-13 durante a infecção, um nocaute (?Rv1419) foi gerado. Um aumento significativo na morte celular foi observado em macrófagos infectados com ?Rv1419, assim como o crescimento intracelular exacerbado em comparação com a infecção pela bactéria selvagem. Análises in silico da proteína, assim como a sua detecção na superfície do Mtb, sugerem que a sMTL-13 pode atuar na entrada da bactéria durante interação inicial patógeno-hospedeiro. Isto foi confirmado através de experimentos de adesão, onde foi observado que a capacidade do bacilo em se ligar à membrana do macrófago é afetada pela ausência da sMTL-13. Além disto, níveis mais baixos de TNF foram detectados em macrófagos infectados com ?Rv1419, sugerindo que esta lectina pode ser importante para o reconhecimento do bacilo. Ademais, foi observado que a proteína purificada pode levar à morte celular via necrose em condições onde a função de caspase está bloqueada. Portanto, nós especulamos que a sMTL-13 regula a morte celular e produção de citocina pró-inflamatória como uma estratégia de sobrevivência, permitindo o crescimento do patógeno sem levar as células hospedeiras à morte prematura.Abstract : Infection by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) can lead to a latent state in which the host is able to control pathogen growth. While effective cellular immune responses are critical to control Mtb growth inside macrophages, it has been demonstrated that mycobacteria-associated factors play an important role in the outcome of infection. Given the high impact in public heath caused by tuberculosis (TB), inefficient vaccine and emergence of Mtb resistant strains, there is a need for novel diagnosis, treatment and vaccine strategies against TB. We have previously described a novel secreted 13-kDa lectin in pathogenic Mtb (sMTL-13) and although a possible importance for this protein as a major mycobacterial antigen was shown in TB patients, fundamental questions on the biology of this lectin remain to be answered. In order to investigate the possible role of sMTL-13 during infection, a knock out mutant (?Rv1419) was generated. Significant cell death was observed in ?Rv1419-infected macrophages as well as increased knockout intracellular growth compared to infection with wild type bacteria. In silico analysis of the protein as well as its detection on the surface of Mtb suggests sMTL-13 may act during bacteria entry in the cell in the initial pathogen-host interactions. This was confirmed by binding experiments where it was observed that the adhesion of bacilli is affected in the absence of sMTL-13. Furthermore, lower levels of TNF were detected in ?Rv1419-infected macrophages, suggesting that this lectin may be important for cell recognition. In addition, it was shown that this purified protein can lead to cell death in a necrotic pathway in conditions where the function of caspases is impaired. Therefore, we speculate that sMTL-13 regulates cell death and pro-inflammatory cytokine production as a survival strategy, allowing pathogen growth without leading host cells to a premature death

Estudo da resposta inflamatória durante a infecção por Trypanosoma rangeli

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.O protozoário parasito não virulento Trypanosoma rangeli tem sido proposto como um possível vetor vacinal na proteção contra Trypanosoma cruzi, agente causativo da doença de Chagas. Entretanto, detalhes na interação parasito-hospedeiro durante a infecção por T. rangeli são pouco conhecidos. Neste estudo, as curvas de parasitemia assim como a resposta imune de camundongos Balb/C injetados i.p. com tripomastigotas derivados de cultura de T. rangeli (cepa Choachí) ou T. cruzi (cepa Y) foram analisados. Em contraste com a infecção por T. cruzi, que apresentou um pico de parasitemia no oitavo dia pós infecção (p.i.), tripomastigotas de T. rangeli foram encontrados no sangue de camundongos infectados a partir de 1 dia pós infecção (dpi), apresentando um pico de parasitemia 5 dpi, não sendo mais encontrado no sangue 11 dpi. Além disto, camundongos infectados com T. rangeli apresentaram aumento de expressão das citocinas IFN-γ, IL-12p40, IL-6 e TNF-α, além de níveis elevados de citocinas séricas como IL-12p70, MCP-1 e IFN-γ. A análise histológica do fígado mostrou que este parasito promove um infiltrado rico em células mononucleares observado até 30 dpi, sugerindo que estas células estão envolvidas na interação T. rangeli-hospedeiro. Para investigar mais a fundo as interações entre o parasito e o hospedeiro, foram realizadas infecções in vitro com este parasito. A análise por microscopia de luz de macrófagos incubados com tripomastigotas de T. rangeli indicou que a maioria dos parasitos não se encontra dentro dos macrófagos. No entanto, foi detectada a produção de TNF-α e IL-6 durante a infecção, o que indica que estes parasitos são reconhecidos pelos macrófagos levando à formação de uma resposta inflamatória. Estes resultados sugerem que T. rangeli pode modular a fagocitose de macrófagos e induzir uma resposta inflamatória persistente in vivo.The avirulent protozoan parasite Trypanosoma rangeli has been proposed as a possible vaccine vector protecting against T. cruzi, the causative agent of Chagas disease. However, details on parasite-host interactions during T. rangeli infection are poorly known. In this study, parasitemia as well as immune responses of Balb/C mice i.p. injected with culture-derived trypomastigotes of either T. rangeli (Choachí strain) or T. cruzi (Y strain) were assessed. In contrast with T. cruzi infection, which presented a parasitemia peak on day 8 p.i., T. rangeli trypomastigotes were found in the blood of infected mice as soon as 1 dpi, displaying a peak of parasitemia at 5 days p.i. and cleared from the blood on the 11th day p.i. Moreover, T. rangeli-infected mice displayed increased expression of IFN-γ, IL-12p40, IL-6 e TNF-α as well as high levels of serum cytokines such as IL-12, MCP-1 and IFN-γ. Histological analysis of the liver revealed that this parasite elicited an inflammatory infiltrate rich in mononuclear cells observed up to 30 days p.i., suggesting that these cells may play a role on T. rangeli-host interactions. To investigate further parasite-cell interactions, T. rangeli infectivity was assessed in vitro. Light-microscopy analysis of macrophages incubated with T. rangeli trypomastigotes revealed that the majority of parasites are not inside macrophages. Despite this fact the production of TNF-α e IL-6 was detected during infection. These results suggest that T. rangeli is recognized by macrophages eliciting an inflammatory response and may modulate macrophage phagocytosis and induce persistent inflammatory responses in vivo

Development of a quantitative NS1 antigen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Zika virus detection using a novel virus-specific mAb

Abstract Viruses from the Flaviviridae family, such as Dengue virus (DENV), Yellow fever virus (YFV), and Zika virus (ZIKV) are notorious global public health problems. ZIKV emergence in Polynesia and the Americas from 2013 to 2016 raised concerns as new distinguishing features set it apart from previous outbreaks, including its association with neurological complications and heightened disease severity. Virus detection is impaired as cross-reactivity to other closely related orthoflaviviruses is common among commercially available diagnostic kits. While non-structural protein 1 (NS1) has been used as an early marker of DENV and West Nile virus (WNV) infection, little is known about NS1 expression during ZIKV infection. In the present work, we developed a NS1 capture ELISA using a novel ZIKV-specific monoclonal antibody to study NS1 expression dynamics in vitro in mosquito and human cell lines. While detectable in culture supernatants, higher concentrations of NS1 were predominantly cell-associated. To our knowledge, this is the first report of NS1 detection in human cells despite viral clearance over time. Tests with human samples need to be conducted to validate the applicability of NS1 detection for diagnosis, but overall, the tools developed in this work are promising for specific detection of acute ZIKV infection