Importance of the endoplasmic reticulum for mRNA translation under hypoxia

Einleitung: Eine herabgesetzte intrazelluläre Verfügbarkeit des Energieäquivalents Adenosintriphosphat (ATP) ist eine Hauptfolge von Hypoxie, da aufgrund des Sauerstoffmangels die oxidative Phosphorylierung gehemmt wird. Zellen reagieren hierauf, indem sie ihren Metabolismus ändern und anaerobe Glykolyse in größerem Ausmaß als ATP produzierenden Prozess nutzen. Der relative Energiemangel führt zu einer globalen Unterdrückung der mRNA Translation, welche zu den energieintensivsten intrazellulären Prozessen gehört. Einige Transkripte entziehen sich jedoch der allgemeinen Hemmung der Translationsrate und können ihre normale translationelle Aktivität behalten oder erhöhen diese sogar noch. Verschiede Mechanismen, wie etwa die „IRES“ (Internal Ribosome Entry Site)-abhängige Translationsinitiation oder eine Regulation durch „upstream open reading frames“ wurden vorgeschlagen, um die erhöhte Proteinsyntheserate spezifischer mRNAs unter den Bedingungen einer globalen Hemmung zu erklären. Eine übergreifende Erklärung, die diese Transkripte als funktionales Operon kennzeichnet, gab es bisher nicht. Methodik: Wir untersuchten die Auswirkungen von Sauerstoffmangel (1% O2 vs. 21% O2 für 36 h) auf die mRNA Translation in humanen Fibrosarkomzellen (HT1080). Mittels qPCR wurde das Niveau von hypoxie-induzierbaren und nicht- hypoxie-induzierbaren Kandidaten-mRNAs in verschiedenen subzellulären Kompartimenten, in denen Proteinsynthese abläuft, bestimmt. Diese Daten wurden mit dem im Westernblot dargestellten korrespondierenden Proteinmengen als Annäherung an die netto- Genexpressionsrate verglichen. Die mRNA Translationsrate im zytoplasmatischem Kompartiment wurde mittels Polysomengradientenanalyse bestimmt. Microarray Daten der durch Menge und Lokalisation definierten mRNA Subpopulationen ermöglichte uns eine „gene ontology“ Analyse, und die in silico Suche nach angereicherten cis- Elementen. Die Funktionalität dieser Elemente wurde durch Reporter-Gen Experimente überprüft. Fluoresence-in-situ-Hybridisierung (FISH) wurde genutzt, um Ergebnisse zur mRNA Lokalisation zu verifizieren. Ergebnisse: Eine spezifische Gruppe von mRNAS zeigt unter Hypoxie eine erhöhte Präsenz am Endoplasmatischen Retikulum (ER). Transkripte, die sowohl in ihrer Gesamtmenge als auch in ihrer Lokalisation am ER unter Hypoxie erhöht waren, zeigten eine Anreicherung von Genen, die den Signalwegen „response to hypoxia”, “glycolysis” und “HIF-1alpha transcription factor network” zugehören. Die 5`- und 3`- untranslatierten Regionen (UTRs) dieser mRNAs zeigen einen hohen Grad an Konservierung und eine unterdurchschnittliche Anzahl von „upstream initiation codons“ (uAUG). Spezifische cis- Elemente in den UTRs dieser mRNAs sind mit einer erhöhten Translationsrate unter Hypoxie assoziiert, welche mit einer vermehrten Lokalisation am ER korreliert. Fazit: Die Regulation der sub-zellulären Lokalisation spezifischer Transkripte stellt einen neuen Mechanismus dar, der unter den Bedingungen einer globalen Hemmung der mRNA Translation entscheidend für die Proteinsyntheserate ist. Wir identifizierten das ER als subzelluläres Kompartiment, in dem unter Sauerstoffmangel induziertem Hypometabolismus die mRNA Translation bevorzugt abläuft, während die Synthese an freien (zytoplasmatischen) Polysomen gehemmt wird.Introduction: One major consequence of hypoxia is reduced intracellular energy availability. Cells react by adjusting their metabolism, favoring anaerobic glycolysis as an adenosine triphosphate (ATP) producing process. Lowered energy levels also lead to a global inhibition of mRNA translation, which represents the most energy-intensive cellular process. Nevertheless, specific transcripts elude this global translational repression, and maintain or even increase their translational activity. Several mechanisms, including internal ribosome entry sites (IRES) dependent initiation of translation and regulation through upstream open reading frames, were proposed in order to explain elevated protein synthesis of specific mRNAs under conditions of global translational suppression. However, no clear consensus on how to explain effective mRNA translation in hypoxia has been reached yet. Methods: We investigated mRNA levels of hypoxia inducible or non-inducible gene candidates via qPCR in different subcellular compartments which are associated with protein synthesis during long term hypoxia (1% O2 vs. 21% O2 for 36 h) in human fibrosarcoma cells (HT1080). Protein levels were detected by Western blot analysis to estimate the net outcome of protein synthesis relative to the respective mRNA level. Polysomal gradient analysis was performed to analyze the translational efficiency of mRNAs in the cytosolic compartment. Microarray data of RNA subpopulations defined by their subcellular localization were used to perform a gene ontology analysis, and for an in silico search for enriched cis-elements. We verified the functionality of these elements by reporter-gene assays. Fluoresence-in-situ-hybridisation (FISH) was used to verify our findings of alterations of mRNA localization. Results: A specific subset of transcripts shows an increased presence at the endoplasmic reticulum (ER) which is associated with ongoing translation during hypoxia. Transcripts up- regulated at the expression level as well as their ER localization belong to crucial hypoxia related gene groups such as “response to hypoxia”, “glycolysis”, and “HIF-1alpha transcription network”. Both the 5`- and 3`- untranslated regions (UTRs) of these mRNAs show a high conservation among species, and an upstream initiation codon (uAUG) count below average. We identified enriched cis-elements in the UTRs of these transcripts that are associated with an increased rate of mRNA translation in hypoxia that is attributed to selective mRNA localization at the ER. Summary: We show that subcellular partitioning of specific transcripts represents a novel mechanism for the adaptation of gene expression during hypoxia. We identified the ER as a crucial compartment for the control of translational activity of transcripts encoding survival factors during hypoxia induced hypometabolism