Development of a biosensor for the rapid detection of hormones and toxins in food and water

Οι πρόσφατες εξελίξεις στους τομείς της βιοαναλυτικής χημείας και της μικροηλεκτρονικής οδήγησαν σε μια αυξανόμενη τάση μεταφοράς των κλασσικών αναλυτικών μεθόδων από τον εργαστηριακό πάγκο, στο πεδίο, μέσω της ανάπτυξης φορητών συσκευών ή μικροσυστημάτων βασισμένων σε βιοαισθητήρες. Οι βιοαισθητήρες είναι αυτοτελείς ενσωματωμένες συσκευές συνήθως σε μεγαλύτερα αναλυτικά όργανα, ικανές να παρέχουν αναλυτικές πληροφορίες χρησιμοποιώντας μόρια βιολογικής αναγνώρισης σε άμεση χωρική επαφή με μεταλλάκτη. Οι πληροφορίες που δίνουν μπορούν να κυμαίνονται από τη συγκέντρωση ενός συγκεκριμένου συστατικού δείγματος έως την ολική ανάλυση της σύνθεσης. Οι φυτικές ορμόνες (αυξίνες) εμπλέκονται στην πλειονότητα των διαδικασιών που συνδέονται με την ανάπτυξη των φυτών, την κατάλληλη εξέλιξη και αναπαραγωγή. Μεταξύ των φυτικών ορμονών που προσελκύουν ιδιαίτερη προσοχή και αποτελούν το αντικείμενο εκτεταμένων μελετών, η ειδική θέση ανήκει στο Ινδολο-3-Οξικό Οξύ (IAA) που είναι η κύρια φυσική αυξίνη και το παράγωγο της Ναφθαλενικό Οξικό Οξύ (NAA). Οι θαλάσσιες νευροτοξίνες είναι φυσικά προϊόντα που παράγονται κυρίως από φυτοπλαγκτόν μαζί με διάφορους τύπους ασπόνδυλων και επιλεγμένα είδη ψαριών. Η Σαξιτοξίνη (STX) είναι μια ισχυρή νευροτοξίνη και η πιο γνωστή παραλυτική τοξίνη οστρακοειδών (PST). Η κατάποση Σαξιτοξίνης συνήθως με την κατανάλωση οστρακοειδών μολυσμένων από τοξικές ανθοφόρες φυλές, είναι υπεύθυνη για την ασθένεια, γνωστή ως παραλυτική δηλητηρίαση οστρακοειδών. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε κατ' αρχήν ένας πρότυπος ηλεκτροχημικός βιοαισθητήρας για τον προσδιορισμό της συνθετικής φυτικής ορμόνης του Ναφθαλενικού Οξικού Οξέος (NAA) σε φρούτα και λαχανικά. Αυτός ο βιοαισθητήρας κατασκευάστηκε με εναπόθεση νανόφυλλων γραφενίου πάνω σε σύρμα χαλκού (d = 0,25 mm) τοποθετημένου επί ενός φίλτρου από υαλώδεις ίνες και ακινητοποιημένη λιπιδική μεμβράνη με ενσωματωμένους τους υποδοχείς δέσμευσης της πρωτεΐνης- αυξίνης (ΑΒΡ1) για τον προσδιορισμό του ΝNA. Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα έγχυσης ροής (flowinjection) με ρυθμό προσθήκης 2 mL / min από υδατικά διαλύματα ΝΝΑ των 10 και 20 mL. Η απόκριση του αισθητήρα σε διάφορες συγκεντρώσεις NAA, βρέθηκε να παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία (~56 mV/ δεκάδα συγκεντρώσεων) για μια ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων του ΝΑΑ που κυμαινόταν από 50x10-9 M έως 10x10-6 M. Το πλέον κατάλληλο περιβάλλον για να γίνουν οι μετρήσεις βρέθηκε να είναι σε pH=7. Στον προτεινόμενο βιοαισθητήρα έγινε έλεγχος αναγεννησιμότητας με ρυθμό ροής 2,0 mL/6 λεπτά με 10 επιτυχείς αναγεννήσεις. Το όριο ανίχνευσης, με βάση τη χαμηλότερη συγκέντρωση που θα μπορούσε να μετρηθεί αξιόπιστα προσδιορίστηκε σε (LOD= 10 nΜ) και (LΟQ=14 nM). O έλεγχος του βιοαισθητήρα σε πρότυπα διαλύματα ΝΑΑ συγκέντρωσης 7x10-7 Μ έγινε με την παρουσία συνηθισμένων παρεμποδιστών που απαντώνται σε φρούτα και λαχανικά, χωρίς να παρατηρηθούν σημαντικές μεταβολές στο σήμα του ΝΑΑ. Στη συνέχεια έγινε αξιολόγηση / επικύρωση αυτού του βιοαισθητήρα με τη χρήση 36 δειγμάτων φρούτων και λαχανικών. Οι ανακτήσεις στα δείγματα αυτά κυμάνθηκαν μεταξύ 91-106 % και για τα χαμηλά και υψηλά επίπεδα NAA. Η συσκευή μπορεί να κατασκευαστεί πολύ εύκολα, έχει εξαιρετικά αναπαραγώγιμα αποτελέσματα και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί πολλές φορές. Η παρούσα τεχνολογία μπορεί να προσαρμοστεί για την ανίχνευση άλλων ορμονών σε φρούτα και λαχανικά.‘Oταν η συγκέντρωση του NAA βρίσκεται πάνω από το θεσμοθετημένο όριο των 0.07 mg/Kg σωματικού βάρους/ημέρα είναι επιβλαβής και προκαλεί οξεία τοξικότητα, ερεθισμό του αναπνευστικού συστήματος και οφθαλμικές βλάβες (EnvironmentalProtectionAgency: case 0379, 2007; Οδηγία 91/414 ΕΟΚ; Κανονισμός 546/2011). Στη συνέχεια αναπτύχθηκε ένας μικροσκοπικός ποτενσιομετρικός βιοαισθητήρας για την ανίχνευση Σαξιτοξίνης (STX) χρησιμοποιώντας έγχυση ροής με ρυθμό προσθήκης 2 mL / min για υδατικά διαλύματα STX των 10-20 μL. Ο βιοαισθητήρας αυτός παρασκευάστηκε, όπως προηγουμένως για το ΝΑΑ, με εναπόθεση σε σύρμα χαλκού στοιβάδων γραφενίου σε φίλτρο από υαλώδεις ίνες με ενσωματωμένες λιπιδικές μεμβράνες και η αντι-STX (ο φυσικός υποδοχέας σαξιτοξίνης) ακινητοποιημένη στις σταθεροποιημένες λιπιδικές μεμβράνες. Η απόκριση του βιοαισθητήρα σε διάφορες συγκεντρώσεις της σαξιτοξίνης, βρέθηκε να παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία (~60 mV/ δεκάδα συγκεντρώσεων) για μια ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων της τοξίνης που κυμαινόταν από 1 Χ 10-9 Μ έως 1 Χ 10-6 Μ σε pH=7. Στον προτεινόμενο βιοαισθητήρα έγινε έλεγχος αναγεννησιμότητας με βέλτιστη τιμή συνεχούς ροής 2,0 mL/λεπτό για 10 λεπτά με 10 επιτυχείς αναγεννήσεις (διατήρηση της αρχικής δραστικότητάς του).Ο έλεγχος του βιοαισθητήρα σε προσομοιωμένα δείγματα νερών λίμνης ήταν επιτυχής και δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές υπό την επίδραση επτά συνηθισμένων παρεμποδιστών σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης (χαμηλό, μεσαίο και υψηλό) που εισήχθησαν σε εμβολιασμένα με STX πρότυπα δείγματα. Ακολούθησε μελέτη του βιοαισθητήρα σε 10 δείγματα πραγματικού νερού λίμνης και υπολογίστηκε το ποσοστό ανάκτησης της τοξίνης 90-106% για τη χαμηλή συγκέντρωση (50 nM) και 95-102% για την υψηλή συγκέντρωση (1 μM). Το όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε με βάση τη χαμηλότερη συγκέντρωση που μπορεί να μετρηθεί αξιόπιστα (S/N=3) και βρέθηκε (LOD=1nM), ενώ το όριο ποσοτικοποίησης βρέθηκε (LOQ=3nM).Το όριο ανίχνευσης του βιοαισθητήρα είναι κάτω από το επιτρεπόμενο όριο τιμών (80 μg/100 σάρκας οστρακοειδών) που έχει ορίσει η Ευρωπαϊκή Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίμων [TheEFSAJournal 1019, 1-7, (2009)] γεγονός που καθιστά το βιοαισθητήρα κατάλληλο για την ανίχνευση της Σαξιτοξίνης. Η καταλληλότητα του αισθητήρα που αναπτύξαμε επαληθεύθηκε περαιτέρω σε δείγματα νερού λίμνης εμβολιασμένα με STX και σε δείγματα νωπών οστρακοειδών

Development of biosensor for the rapid detection of hormones and toxins with application in food and water

Biosensors are self-contained integrated devices capable to provide analytical information using biological recognition molecules in direct spatial contact with a transducer. Nanotechnology has offered a method for preparing nanosensors based on lipid membranes by using graphene electrodes. Biosensors that are based on lipid membranes provide many advantages over thestandard analytical methods, including rapid responsetimes, small size, low cost, time efciency, portability for use in the eld, and most importantly,biosensors are biocompatible.Research is now being directed to the use of nanotechnological advance to construct portable nanosensors with better characteristics that can be used for the eld and in situ determination of analytes, such as phytohormones, allergens, antibiotics, polycyclic aromatic hydrocarbons and other toxicants in foods and the environment, which will in turn improve human safety.In the present Ph. D. thesis, a standard electrochemical biosensor was first developed to determine Naphthalene Acetic Acid (NAA) in fruits and vegetables. This biosensor was made by depositing graphene nanosheets on a copper wire placed on a glass fiber filter and immobilized lipid membrane with incorporated the Auxin- binding protein (ABP-1) receptor to determine the NNA. The flow injection system in aliquots of aqueous NNA solutions was used. The sensor showed a highly stable output has along with a good linear sensitivity curve over a large dynamic range from 50×10−9 M to 10×10−6 M of NAA at pH 7,0. The detection limit was 10 nM of NAA and the response times were about 5 minutes. The device can be manufactured very easily, has extremely reproducible results and can be reused many times. The shelf life was very long and the slope of the potentiometric nanoscale was 56 mV / decade of NAA concentration. The evaluation / validation of this biosensor was made by spiked using fruit and vegetables.A second miniaturized potentiometric biosensor was developed for the detection of Saxitoxin (STX) using flow injection for aqueous fractions of STX. This biosensor was prepared, like previously for NAA, by deposition in copper wire of graphene layers on a glass fiber filter with integrated lipid membranes and Anti-STX, the native saxitoxin receptor, immobilized on the stabilized lipid membranes. The sensor showed fast response times (5-20 minutes) and good linear sensitivity curve over a large dynamic range from 1 × 10-9 M to 1 × 10-6 M as STX at pH 7.0. The detection limit, based on the lowest concentration that could be measured reliably (S / N = 3), was 1 nM. The proposed sensor is easy to manufacture and has good reproducibility, reusability, selectivity, long life and high sensitivity of about 60 mV / decade toxin concentration. The suitability of the sensor we developed was further verified on STX‐spiked lake water samples and in fresh shellfish samples.Οι βιοαισθητήρες είναι αυτοτελείς ενσωματωμένες συσκευές ικανές να παρέχουν αναλυτικές πληροφορίες χρησιμοποιώντας μόρια βιολογικής αναγνώρισης σε άμεση χωρική επαφή με μεταλλάκτη. Η νανοτεχνολογία έχει προσφέρει μια μέθοδο για την παρασκευή νανοαισθητήρων με βάση λιπιδικές μεμβράνες χρησιμοποιώντας ηλεκτρόδια γραφενίου. Οι βιοαισθητήρες που βασίζονται σε λιπιδικές μεμβράνες παρέχουν πολλά πλεονεκτήματα έναντι των τυπικών αναλυτικών μεθόδων, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου ταχείας απόκρισης, το μικρό μέγεθος, το χαμηλό κόστος, τη χρονική αποτελεσματικότητα, τη φορητότητα για χρήση στο πεδίο. Η έρευνα τώρα κατευθύνεται προς τη χρήση της νανοτεχνολογικής προόδου για την κατασκευή φορητών νανοαισθητήρων με καλύτερα χαρακτηριστικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον καθορισμό και επιτόπιο προσδιορισμό αναλυτών, όπως φυτορμόνες, αλλεργιογόνα, αντιβιοτικά, πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες, και άλλες τοξικές ουσίες στα τρόφιμα και στο περιβάλλον. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε κατ'αρχήν ένας πρότυπος ηλεκτροχημικός βιοαισθητήρας για τον προσδιορισμό του Ναφθαλενικού Οξικού Οξέος (NAA) σε φρούτα και λαχανικά. Αυτός κατασκευάστηκε με εναπόθεση νανόφυλλων γραφενίου πάνω σε σύρμα χαλκού τοποθετημένου επί ενός φίλτρου από υαλώδεις ίνες και ακινητοποιημένη λιπιδική μεμβράνη με ενσωματωμένους τους υποδοχείς δέσμευσης της πρωτεΐνης- αυξίνης (ΑΒΡ1) για τον προσδιορισμό του ΝNA. Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα έγχυσης ροής σε κλάσματα υδατικών διαλυμάτων ΝΝΑ. Ο αισθητήρας έδειξε εξαιρετικά σταθερή απόδοση μαζί με καλή γραμμική καμπύλη ευαισθησίας σε μεγάλη δυναμική περιοχή από 50 x10-9M έως 10x10-6M NAA σε pH 7,0. Το όριο ανίχνευσης, ήταν 10 nΜ ΝΑΑ και οι χρόνοι απόκρισης ήταν περίπου 5’. Η συσκευή μπορεί να κατασκευαστεί πολύ εύκολα, έχει εξαιρετικά αναπαραγώγιμα αποτελέσματα και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί πολλές φορές. Η διάρκεια ζωής ήταν πολύ μεγάλη και η κλίση του ποτενσιομετρικού νανοαισθητήρα ήταν 56 mV / δεκάδα συγκέντρωσης NAA. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε ένας δεύτερος μικροσκοπικός ποτενσιομετρικός βιοαισθητήρας για την ανίχνευση Σαξιτοξίνης (STX) χρησιμοποιώντας έγχυση ροής για υδατικά κλάσματα STX. Ο βιοαισθητήρας αυτός παρασκευάστηκε με εναπόθεση σε σύρμα χαλκού στοιβάδων γραφενίου σε φίλτρο από υαλώδεις ίνες με ενσωματωμένες λιπιδικές μεμβράνες και η αντι-STX (ο φυσικός υποδοχέας σαξιτοξίνης) ακινητοποιημένη στις σταθεροποιημένες λιπιδικές μεμβράνες. Ο αισθητήρας έδειξε γρήγορους χρόνους απόκρισης (5-20 λεπτά) και καλή καμπύλη γραμμικής ευαισθησίας σε μεγάλη δυναμική περιοχή από 1 × 10-9 M έως 1 × 10-6 M ως STX σε pH 7,0. Το όριο ανίχνευσης, με βάση τη χαμηλότερη συγκέντρωση που μπορεί να μετρηθεί αξιόπιστα (S/N = 3), βρέθηκε 1nM. Ο προτεινόμενος αισθητήρας είναι εύκολος στην κατασκευή και έχει καλή αναπαραγωγιμότητα, επαναχρησιμοποίηση, επιλεκτικότητα, μεγάλη διάρκεια ζωής και υψηλή ευαισθησία συγκέντρωσης περίπου 60 mV / δεκάδα. Η καταλληλότητα του αισθητήρα που αναπτύξαμε επαληθεύθηκε περαιτέρω σε δείγματα νερού λίμνης εμβολιασμένα με STX και σε δείγματα νωπών οστρακοειδών

The Role of Fungi in Food Production and Processing

Fungi play an important and multifaceted role in the production and processing of food, influencing various stages from cultivation to consumption. This paper explores the complex relationship between fungi and food systems, highlighting their diverse contributions. Firstly, fungi serve as essential agents in food cultivation, aiding in the breakdown of organic matter and the recycling of nutrients, and promoting plant growth through symbiotic relationships. Moreover, fungi such as yeasts and molds are integral to fermentation processes, yielding a wide array of fermented foods and beverages with unique flavors and textures. Additionally, fungi are indispensable in the creation of enzymes and bioactive compounds utilized in food processing, enhancing the nutritional value, shelf life, and safety. However, certain fungal species pose significant challenges as food spoilage agents and mycotoxin producers, necessitating stringent quality control measures. Understanding the intricate interplay between fungi and food systems is essential for optimizing food production, ensuring food security, and mitigating the risks associated with fungal contamination. This paper synthesizes current research to elucidate the important role that fungus play in shaping the modern food industry and underscores the importance of ongoing scientific inquiry in harnessing their potential for sustainable and safe food production

Recent Lipid Membrane-Based Biosensing Platforms

The investigation of lipid films for the construction of biosensors has recently given the opportunity to manufacture devices to selectively detect a wide range of food toxicants, environmental pollutants, and compounds of clinical interest. Biosensor miniaturization using nanotechnological tools has provided novel routes to immobilize various “receptors” within the lipid film. This chapter reviews and exploits platforms in biosensors based on lipid membrane technology that are used in food, environmental, and clinical chemistry to detect various toxicants. Examples of applications are described with an emphasis on novel systems, new sensing techniques, and nanotechnology-based transduction schemes. The compounds that can be monitored are insecticides, pesticides, herbicides, metals, toxins, antibiotics, microorganisms, hormones, dioxins, etc

Biosensors Based on Lipid Modified Graphene Microelectrodes

Graphene is one of the new materials which has shown a large impact on the electronic industry due to its versatile properties, such as high specific surface area, high electrical conductivity, chemical stability, and large spectrum of electrochemical properties. The graphene material-based electronic industry has provided flexible devices which are inexpensive, simple and low power-consuming sensor tools, therefore opening an outstanding new door in the field of portable electronic devices. All these attractive advantages of graphene give a platform for the development of a new generation of devices in both food and environmental applications. Lipid-based sensors have proven to be a good route to the construction of novel devices with improved characteristics, such as fast response times, increased sensitivity and selectivity, and the possibility of miniaturization for the construction of portable biosensors. Therefore, the incorporation of a lipid substrate on graphene electrodes has provided a route to the construction of a highly sensitive and selective class of biosensors with fast response times and portability of field applications for the rapid detection of toxicants in the environment and food products

Biosensors Based on Lipid Modified Graphene Microelectrodes

Graphene is one of the new materials which has shown a large impact on the electronic industry due to its versatile properties, such as high specific surface area, high electrical conductivity, chemical stability, and large spectrum of electrochemical properties. The graphene material-based electronic industry has provided flexible devices which are inexpensive, simple and low power-consuming sensor tools, therefore opening an outstanding new door in the field of portable electronic devices. All these attractive advantages of graphene give a platform for the development of a new generation of devices in both food and environmental applications. Lipid-based sensors have proven to be a good route to the construction of novel devices with improved characteristics, such as fast response times, increased sensitivity and selectivity, and the possibility of miniaturization for the construction of portable biosensors. Therefore, the incorporation of a lipid substrate on graphene electrodes has provided a route to the construction of a highly sensitive and selective class of biosensors with fast response times and portability of field applications for the rapid detection of toxicants in the environment and food products

Protein-Based Graphene Biosensors: Optimizing Artificial Chemoreception in Bilayer Lipid Membranes

Proteinaceous moieties are critical elements in most detection systems, including biosensing platforms. Their potential is undoubtedly vast, yet many issues regarding their full exploitation remain unsolved. On the other hand, the biosensor formats with the higher marketability probabilities are enzyme in nature and electrochemical in concept. To no surprise, alternative materials for hosting catalysis within an electrode casing have received much attention lately to demonstrate a catalysis-coated device. Graphene and ZnO are presented as ideal materials to modify electrodes and biosensor platforms, especially in protein-based detection. Our group developed electrochemical sensors based on these nanomaterials for the sensitive detection of cholesterol using cholesterol oxidase incorporated in stabilized lipid films. A comparison between the two platforms is provided and discussed. In a broader sense, the not-so-remote prospect of quickly assembling a protein-based flexible biosensing detector to fulfill site-specific requirements is appealing to both university researchers and industry developers

Nano-enabled medical devices based on biosensing principles: technology basis and new concepts

Research and development in the biosensors for medical applications remain a focused area benefiting industry, society and knowledge production alike. The framework established is conducive to innovation and rapid assimilation of technological change. At the advent of nanotechnology, the various biosensor classes have been benefited in different ways, scales and rates. This paper studies the nanotechnology-driven shifting of the biosensor innovation system towards new concepts and the broadening, in depth and extent, of its science base. The scientific domain of (nano)biosensors has been studied using a roadmapping framework, especially developed to handle the dynamics and scopes of academic research. The results indicate that the sector seized the opportunities that nanotools offered to solve technology problems and revisit old concepts for optimizing the traditional platforms. Yet, the ability to control nanoeffects fuels a new transition towards bioelectronic integration that sets entirely new horizons for future trajectories