The Restriction of Zoonotic PERV Transmission by Human APOBEC3G

The human APOBEC3G protein is an innate anti-viral factor that can dominantly inhibit the replication of some endogenous and exogenous retroviruses. The prospects of purposefully harnessing such an anti-viral defense are under investigation. Here, long-term co-culture experiments were used to show that porcine endogenous retrovirus (PERV) transmission from pig to human cells is reduced to nearly undetectable levels by expressing human APOBEC3G in virus-producing pig kidney cells. Inhibition occurred by a deamination-independent mechanism, likely after particle production but before the virus could immortalize by integration into human genomic DNA. PERV inhibition did not require the DNA cytosine deaminase activity of APOBEC3G and, correspondingly, APOBEC3G-attributable hypermutations were not detected. In contrast, over-expression of the sole endogenous APOBEC3 protein of pigs failed to interfere significantly with PERV transmission. Together, these data constitute the first proof-of-principle demonstration that APOBEC3 proteins can be used to fortify the innate anti-viral defenses of cells to prevent the zoonotic transmission of an endogenous retrovirus. These studies suggest that human APOBEC3G-transgenic pigs will provide safer, PERV-less xenotransplantation resources and that analogous cross-species APOBEC3-dependent restriction strategies may be useful for thwarting other endogenous as well as exogenous retrovirus infections

Das Disziplinarrecht des europäischen öffentlichen Dienstes

Specke P. Das Disziplinarrecht des europäischen öffentlichen Dienstes. Bielefeld; 2001

Porcine endogene Retroviren als Risiko bei der Xenotransplantation?

Der Mangel an verfügbaren Allotransplantaten und deren notwendigen Bedarf für die Klinik, resultiert in der Entwicklung neuer Ansätze für die Therapie der betroffenen Patienten. Die Transplantation von tierischen Zellen, Geweben und Organen auf den Menschen, die sogenannte Xenotransplantation, wird dabei als eine vielversprechende Möglichkeit angesehen. Aus vielfachen Gründen werden zur Zeit Schweine als potentielle Spender von Xenotransplantaten favorisiert. Jedoch ist mit der Verwendung porciner Xenotransplantate das Risiko einer Übertragung von Mikroorganismen auf den humanen Rezipienten verbunden. Dabei wird vermutlich das größte Risiko von den porcinen endogenen Retroviren (PERVs) ausgehen, welche mit über 50 Proviren an zahlreichen Loci im porcinen Genom integriert sind. Im Gegensatz zu den anderen bekannten Mikroorganismen des Schweins gelingt es momentan noch nicht, die PERVs aus dem Schwein zu eliminieren. PERVs gehören in die Gruppe der Gammaretroviren und sind nahe verwandt mit den Leukämieviren der Maus (MuLV) und der Katze (FeLV), welche neben der Verursachung von Leukämien auch Tumore und Immundefizienzen hervorrufen. Für mindestens zwei Subtypen der PERVs konnte gezeigt werden, daß sie humane Zellen in vitro infizieren. Die Transplantation porziner Organe auf den Menschen beinhaltet daher das Risiko einer Übertragung dieser Viren. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit einerseits das Spektrum infizierbarer humaner Zellen untersucht und näher charakterisiert, andererseits Zellen verschiedener Spezies mit Hinblick auf die Etablierung eines Tiermodells auf ihre Suszeptibilität gegenüber einer Infektion mit PERVs getestet. Dabei konnte eine Vielzahl von primären humanen Zellen und Zell-Linien unterschiedener Gewebe produktiv mit PERVs infiziert werden, was darauf hindeutet, daß es im humanen Organismus ein weites Spektrum PERV-suszeptibler Zellen gibt. In diesem Zusammenhang konnte erstmals gezeigt werden, daß sich PERVs an humane Zellen adaptieren. Die serieller Passagierung von PERVs auf humanen 293 Zellen resultierte dabei in einer gesteigerten Replikation der Viren, welche auf genetische Modifikationen in der U3-Region der LTRs zurückgeführt werden konnten. Diese Modifikationen beruhten auf einer Multimerisierung von repetitiven Sequenzen, welche Motive einer Transkriptionsfaktorbindestelle des Transkriptionsfaktors NF-Y enthalten. Dieser ubiquitär vorkommende Transkriptionsfaktor scheint wesentlich dazu beizutragen, daß sich die Viren in den unterschiedlichsten humanen Geweben effizient vermehren können. Für die Evaluierung des Risikos einer Übertragung von PERVs im Rahmen einer Xenotransplantation ist das Infektionspotential von PERVs in vivo von besonderem Interesse. Für die Untersuchung dieses Transmissionsrisikos in vivo wurden verschiedene Kleintiermodelle etabliert, indem naive Ratten, Cyclosporin-A (Cs-A) und Cobra Venom Faktor (CVF) immunsupprimierte Ratten, Meerschweinchen und Nerze mit PERVs inokuliert wurden. Bei keinem der Tiere konnte drei Monate nach der Virus-Applikation eine Antikörperproduktion gegen PERVs, sowie eine Integration proviraler DNA in das Genom verschiedener Gewebezellen beobachtet werden. Des Weiteren wurde ein Tiermodell mit nicht-humanen Primaten etabliert, in welchem ein „worst case scenario“ mit starker Virusfreisetzung nach einer Xenotransplantation simuliert wurde. Um die Situation einer klinischen Xenotransplantation widerzuspiegeln, wurden die nicht-humane Primaten täglich pharmakologisch mit einer Dreifachkombination aus Cs-A, dem Rapamycin-Derivat RAD und Prednisilon imunsupprimiert. Den Tieren wurden hohe Titer an zellfreiem Virus inokuliert, wobei einige Tiere zusätzlich zellassoziiertes Virus in Form von PERV-produzierenden Zellen erhielten. Bei keinem der Tiere ließen sich während des Zeitraumes von einem Jahr freie Virionen oder eine Antikörperbildung gegen PERVs im Serum nachweisen, sowie eine Integration von PERV proviraler DNA in Blutzellen oder Zellen anderer Gewebe detektieren. Die Daten dieser in vivo Studie stehen damit den Ergebnissen von vorausgegangenen in vitro Untersuchungen dieser Arbeit gegenüber, in welchen erstmals die produktive Infektion von primären Zellen der nicht-humaner Primaten gezeigt werden konnte. Da es zu keiner Infektion der Tiere in vivo gekommen ist, obwohl Zellen der selben Tiere für PERV in vitro suszeptibel sind, obwohl eine starke Immunsuppression appliziert wurde und obwohl hohe Titer von PERV inokuliert wurden, bleibt zu vermuten, daß das natürliche Immunsystem der Tiere ausgereicht haben muß, das inokulierte Virus effizient zu eliminieren. Für eine abschließende Einschätzung des Risikos einer Transmission von PERV im Rahmen einer Xenotransplantation, und die daraus eventuell resultierenden Folgen für den Xenotransplantatempfänger und die Gesellschaft, sind daher intensive weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet notwendig, um vor der klinischen Realisierung der Xenotransplantation eine ausreichende Virussicherheit der porcinen Xenotransplantate gewährleisten zu können

Characterisation of a human cell-adapted porcine endogenous retrovirus PERV-A/C.

Background: Porcine endogenous retroviruses (PERVs) pose a potential risk for xenotransplantation using pig cells, tissues or organs. A special threat comes from viruses generated by recombination between human-tropic PERV-A and ecotropic PERV-C. Serial passages of a recombinant PERV-A/C on human 293 cells resulted in increased infectious titers and a multimerization of transcription factor binding sites in the viral long terminal repeat (LTR). In contrast to the LTR, the sequence of the env gene did not change, indicating that the LTR represents the determinant of high infectivity. Material/Methods: The virus was further propagated on human cells and characterized by different methods (titration, sequencing, infection experiments, electron microscopy). Results: Further propagation on human 293 cells resulted in deletions and mutations in the LTR. In contrast to low-titer viruses, the high-titer virus was infectious for cells from non-human primates including chimpanzees. Scanning electron microscopy revealed clustering of budding virions at the cell surface of infected human cells and transmission electron microscopy indicated that the virus infects them via receptor-mediated endocytosis. Conclusions: After propagation of PERV on human cells without selection pressure, viruses with different LTR were generated. High titer PERV was shown to infect cells from non-human primates. The experiments performed here simulate the situation in vivo and give an extended characterization of human cell-adapted PERVs