Molecular characterization of the PhiKo endolysin from Thermus thermophilus HB27 bacteriophage phiKo and its cryptic lytic peptide RAP-29

IntroductionIn the era of increasing bacterial resistance to antibiotics, new bactericidal substances are sought, and lysins derived from extremophilic organisms have the undoubted advantage of being stable under harsh environmental conditions. The PhiKo endolysin is derived from the phiKo bacteriophage infecting Gram-negative extremophilic bacterium Thermus thermophilus HB27. This enzyme shows similarity to two previously investigated thermostable type-2 amidases, the Ts2631 and Ph2119 from Thermus scotoductus bacteriophages, that revealed high lytic activity not only against thermophiles but also against Gram-negative mesophilic bacteria. Therefore, antibacterial potential of the PhiKo endolysin was investigated in the study presented here.MethodsEnzyme activity was assessed using turbidity reduction assays (TRAs) and antibacterial tests. Differential scanning calorimetry was applied to evaluate protein stability. The Collection of Anti-Microbial Peptides (CAMP) and Antimicrobial Peptide Calculator and Predictor (APD3) were used to predict regions with antimicrobial potential in the PhiKo primary sequence. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the RAP-29 synthetic peptide was determined against Gram-positive and Gram-negative selected strains, and mechanism of action was investigated with use of membrane potential sensitive fluorescent dye 3,3′-Dipropylthiacarbocyanine iodide (DiSC3(5)).Results and discussionThe PhiKo endolysin is highly thermostable with melting temperature of 91.70°C. However, despite its lytic effect against such extremophiles as: T. thermophilus, Thermus flavus, Thermus parvatiensis, Thermus scotoductus, and Deinococcus radiodurans, PhiKo showed moderate antibacterial activity against mesophiles. Consequently, its protein sequence was searched for regions with potential antibacterial activity. A highly positively charged region was identified and synthetized (PhiKo105-133). The novel RAP-29 peptide lysed mesophilic strains of staphylococci and Gram-negative bacteria, reducing the number of cells by 3.7–7.1 log units and reaching the minimum inhibitory concentration values in the range of 2–31 μM. This peptide is unstructured in an aqueous solution but forms an α-helix in the presence of detergents. Moreover, it binds lipoteichoic acid and lipopolysaccharide, and causes depolarization of bacterial membranes. The RAP-29 peptide is a promising candidate for combating bacterial pathogens. The existence of this cryptic peptide testifies to a much wider panel of antimicrobial peptides than thought previously

Flowering Phenology of Six Seasonal-Flowering Strawberry Cultivars in a Coordinated European Study

The flowering phenology of six genetically distant strawberry cultivars (‘Candonga®’ (ES), ‘Clery’ (IT), ‘Florence’ (UK), ‘Frida’ (NO), ‘Gariguette’ (FR), and ‘Sonata’ (NL)) was studied for 3 years in relation to climatic parameters in open-field cultivation at three locations (Norway, Poland, Germany) and in soil-less cultivation at two locations (Italy, and France), covering a distance of 16 degrees of latitude. This proved to be a useful approach for unravelling the climatic adaptation and plasticity of strawberry genotypes and their suitability both for profitable cultivation and as a breeding pedigree. Despite the intercorrelated character of the climatic variables, the observed results highlight the importance of global radiation as a powerful modifying phenological factor in strawberry. Generally, early flower initiation was associated with elevated temperature and global radiation. ‘Frida’ revealed the highest dependency on global radiation for flower initiation, while ‘Sonata’ was least affected by temperature and radiation. In general, temperature and global radiation in periods both preceding and following flower initiation had a stronger positive effect on the number of flowers than on crowns, especially under open-field conditions. The influence of these factors was highly variable across the cultivars: ‘Clery’, ‘Florence’, and ‘Gariguette’ were most affected, while ‘Frida’ was least influenced.publishedVersio

Abschätzung der Oberflächenfunktionalisierung von SPION und DND Nanomaterialien für die Zellaufnahme und Fluoreszenzimaging

The aim of this work was to synthesize and functionalize different bio-relevant nanomaterials like silica-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) as contrast agents for T2 magnetic resonance imaging (MRI) and detonation nanodiamond (DND) with the neurohormone peptide allatostatin 1 (ALST1) and a fluorescent dye. Analytical techniques for the determination and quantification of surface functional groups like amines, azides, and peptides were also developed and established. Thus, in the first part of the work, a TGF-1 binding peptide and allatostatin 1 (ALST1), both supposed to act as active tumour targeting vectors, were synthesized by solid-phase peptide synthesis (SPPS) and characterized by high pressure liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry. Then, azide-functionalized silica nanoparticles were synthesized by the Stöber process and characterized by transmission electron microscopy (TEM) and infrared spectroscopy (IR). The surface loading of amine and azide groups was determined by a new protocol. The azide groups were reduced with sodium boronhydride to amine and then functionalized with Fmoc-Rink Amide linker according to a standard SPPS protocol. Upon cleavage of Fmoc by piperidine, the resulting dibenzofulvene and its piperidine adduct were quantified by UV/Vis spectroscopy and used to determine the amount of amine groups on the nanoparticle surface. Then, ALST1 and related tyrosine- and phenylalanine substituted model peptides were conjugated to the azide-functionalized silica nanoparticles by copper(I)-catalyzed azide-alkyne dipolar cycloaddition (CuAAC). The successful peptide conjugation was demonstrated by the Pauly reaction, which however is only sensitive to histidine- and tyrosine-containing peptides. As a more general alternative, the acid hydrolysis of the peptides to their individual amino acid building blocks followed by derivatization with phenyl isothiocyanate (PITC) allowed the separation, determination, and quantification of the constituent amino acids by HPLC. In the second part of the work, amine- and azide-functionalized silica-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) were synthesized by co-precipitation and subsequent silica-coated based on the Stöber process and characterized by TEM and IR. The amine surface loading was determined by the method already established for the pure silica systems. The azide surface loading could also be quantified by reduction with sodium boronhydride to amine groups and then conjugation to Fmoc-Rink amide linker. Upon cleavage of Fmoc with piperidine, the total amine surface loading was obtained. The amount of azide surface groups was then determined from the difference of the total amine surface loading and the amine surface loading. Thus, it was possible to quantify both amine and azide surface groups on a single nanoparticle system. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) are potent T2 contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). Due to their natural metabolism after injection into the blood stream, SPIONs mostly end up inside macrophages, liver, spleen or kidneys. To generate a potential target-specific SPION-based T2 contrast agent for MRI, the neurohormone peptide ALST1 was conjugated by CuAAC to the azide- and amine functionalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles, since ALST1 is supposed to target difficult-to-treat neuroendocrinic tumours due to its analogy to galanin and somastatin receptor ligands. The organic fluorescent dye cyanine 5 (Cy5) was also conjugated to the silica-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) via a NHS-ester to the amines to enable cell uptake studies by fluorescence microscopy. These constructs were characterized by TEM, dynamic light scattering (DLS), and IR. The amino acids of the conjugated ALST1 were determined by the HPLC method as described before for peptide-modified silica nanoparticle surfaces. Then, the relaxivity r2 was measured at 7 T. However, a r2 value of 27 L/mmolFe·s for the dual ALST1-/Cy5-functionalized silica-coated SPIONs was not comparable to T2 contrast agents in clinical use, since their relaxivity is commonly determined at 1.5 T, and no such instrument was available. However, it can be assumed that the synthesized dual ALST1-/Cy5-functionalized silica-coated SPION would show a lower r2 at 1.5 T than at 7T. Commercial T2 MRI contrast agents like VSOP-C184 from Ferropharm show at r2 values of about 30 L/mmolFe·s at 1.5 T. Still, the relaxivity of the new material has some potential for application as a T2 contrast agent. Then, the material was used in cell uptake studies by fluorescence microscopy with the conjugated Cy5 dye as a probe. The dual ALST1-/Cy5-functionalized silica-coated SPION showed a high degree of agglomeration with no cellular uptake unlike described for ALST1-functionalized nanoparticles in literature. It is assumed that upon agglomeration of the particles, constructs form which are unable to be internalized by the cellular endocytotic pathways anymore. As a future perspective, the tendency of the particle to agglomerate should be reduced by changing the coating material to polyethylene glycol (PEG) or chitosan, which are known to be bio-compatible, bio-degradable and prevent agglomeration. In the third part of the work, the rhenium compound [ReBr(CO)3(L)] with L = 2-phenyl-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthroline and its manganese analogue were synthesized by heating the ligand and rhenium pentacarbonyl bromide or and manganese pentacarbonyl bromide respectively, in toluene. However, [MnBr(CO)3(L)] was unstable upon illumination by UV light at 365 nm. Thus, it was dismissed for further application. The photophysical properties of [ReBr(CO)3(L)] were explored, by determination of the excited-state life time by the time-correlated single-photon counting (TCSPC) method and the quantum yield by a fluorescence spectrometer equipped with an integration sphere. A value of = 455 ns, a Stokes shift of 197 nm and a rather low quantum yield =were found. Metal complexes are supposed to have superior properties compared to organic dyes due to their large Stokes shifts, long excited-state life times, and high quantum yields. Thus, amine- and azide-functionalized detonation nanodiamond (DND) as an alternative biological inert carrier system was functionalized with ALST1 to enhance its cell uptake properties. A luminescent probe for cell uptake studies using fluorescence microscopy was also attached, either based on the new rhenium complex or the commercially available organic dye Cy5, respectively. The aldehyde-functionalized rhenium complex was conjugated to the DND via oxime ligation, which is known to be a mild and catalyst-free conjugation method. The amount of peptide ALST1 on the DND was analyzed and quantified after acid hydrolysis and PITC derivatization by HPLC as described before. Then, the ALST1-/luminescent probe-functionalized DND was investigated for its photophysical properties by fluorescence spectroscopy. The Cy5-functionalized material showed a slightly lower fluorescence performance in aqueous solution than reported in literature and commercial suppliers with a life time < 0.4 ns and quantum yields not determinable by integration sphere due to the week signal intensity. The rhenium complex-functionalized material had a very low signal intensity in only aqueous medium, and thus determination of life times and quantum yield by fluorescence spectroscopy was not possible. After incubation with MDA-MB 231 cells, the Cy5-functionalized DND could easily be detected due to its red fluorescence. However, it was not possible to visualize the rhenium complex-functionalized DND with fluorescence microscopy due to the low fluorescence intensity of the complex in aqueous medium and the lack of proper filters for the fluorescence microscope. Cy5-functionalized DND did not show any cellular uptake in fluorescence microscopy after conjugation with ALST1. Since the nanodiamond surface is known to strongly adsorb peptides and proteins, it is assumed that the peptide chain is oriented perpendicular to the nanoparticle surface and thus not able to interact with cell membrane receptors to promote cell uptake of the particles. As a future perspective, the ALST1-promoted cellular uptake of the DND should be improved by using different linker systems for peptide conjugation to prevent adsorption of the peptide chain on the particle surface. The new analytical methods for amino-, azide-, and peptide-functionalized nanoparticles have great potential to assist in the quantification of nanoparticle surface modifications by UV/Vis spectroscopy and HPLC. The determination of surface amine and azide groups based on the cleavage of conjugated Fmoc-Rink amide linker and detected by UV/Vis spectroscopy is applicable to all amine-/azide-functionalized nanomaterials. However, particles which form very stable suspension with the cleavage mixture can cause quantification problems due to scattering, making an accurate quantification of dibenzofulvene and its piperidine adduct impossible. The detection of tyrosine- and histidine-containing peptides based on the Pauly reaction is well-suited as a fast and easy-to-perform qualitative demonstration of successful peptide surface conjugation. However, its major drawback as a colourimetric approach is that coloured particles cannot be evaluated by this method. The amino acid analysis based on HPLC after acid hydrolysis of peptides conjugated to nanoparticle surfaces to its individual building blocks and subsequent derivatization with PITC, can be used on all nanomaterials with peptide or protein surface modification. It allows detection of amino acids down to picomolar concentrations and even enables analysis of very small peptide surface loadings. However, the resulting HPLC traces are difficult to analyze. Three new analytical methods based on UV/Vis and HPLC techniques have been developed and established. They assisted in the characterization of the synthesized DND and SPIONs with dual functionalization by ALST1 and Cy5 or [ReBr(CO)3(L)], respectively. However, the nanomaterials showed no cellular uptake due to a high tendency to agglomerate. The cellular uptake should be improved and the tendency to agglomerate of the SPIONs should be reduced by changing the surface coating from silica to either PEG or chitosan. Furthermore, different linker systems for connecting peptides to DND surfaces should be synthesized and evaluated to reduce potential peptide chain adsorption.Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese und Funktionalisierung biologisch relevanter Nanomaterialien wie die Silica-umhüllten superparamagnetischen Eisenoxid Nanopartikel (SPIONs) als Kontrastmittel für T2 gewichtete Magnetresonanztomographie (MRT) und Detonantionsnanodiamant mit dem Neurohormonpeptid Allatostatin 1 (ALST1) sowie einem Fluoreszenzfarbstoff. Des Weiteren sollten analytische Methoden zur Bestimmung und Quantifizierung von funktionellen Oberflächenmodifikationen wie Amine, Azide und Peptide entwickelt und etabliert werden. Aus diesem Grund wurden im ersten Teil der Arbeit ein TGF-1 bindendes Peptid und Allatostatin 1 (ALST1), welche beide spezifisch Tumorgewebe anzielen, mit Hilfe der Festphasen Peptid Synthese (SPPS) hergestellt und durch HPLC und Massenspektrometrie charakterisiert. Danach wurden Azid-funktionalisierte Silica-Partikel durch den Stöber Prozess hergestellt und mit Hilfe von Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Infrarot Spektroskopie (IR) charakterisiert. Die Oberflächenbeladung von Aminen und Aziden wurde mit einer neuen Methode bestimmt. Azidgruppen wurden mit Natriumborhydrid zu Aminen reduziert und anschließend mit dem Fmoc-Rink Amid Linker unter Verwendung des allgemeinen SPPS Verfahrens. Durch die Abspaltung von Fmoc mit Piperidin wurden Dibenzofulven und sein Piperidin-Adduct gebildet und mit Hilfe von UV/Vis Spektroskopie quantifiziert um die Oberflächenbeladung der Amino-Gruppen auf den Nanopartikeln zu bestimmen. Danach wurden ALST1 und verwandte Tyrosin- und Phenylalanin- substituierte Modellpeptide synthetisiert und durch die Kuper(I)-katalysierte Azid-Alkin dipolare Cycloaddition (CuAAC) an die Oberfläche der Silica-Partikel konjugiert. Die erfolgreiche Peptidkonjugation wurde mit Hilfe der Pauly Reaktion, welche jedoch ausschließlich auf Tyrosin- und Histidin-haltige Peptide und Proteine anwendbar ist, nachgewiesen. Als eine universellere Alternative wurden die Peptid-konjugierten Nanomaterialien mit konzentrierter Salzsäure hydrolysiert und anschließend mit Phenylisothiocyanat (PITC) derivatisiert, was die Trennung, Bestimmung und Quantifikation der individuellen Aminosäuren des Peptids durch HPLC ermöglichte. In dem zweiten Teil dieser Arbeit wurden Amin- und Azid-funktionalisierte Silica-umhüllte superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel (SPIONs) durch Co-Präzipitation und anschließender Silica-Ummantelung basierend auf dem Stöber Prozess synthetisiert und mit Hilfe von TEM und IR charakterisiert. Die Oberflächenbeladung der Aminogruppen wurde an Hand der bereits etablierten Methode für Silica-Partikel bestimmt. Die Oberflächenbeladung der Azidgruppen wurde quantifiziert durch deren Reduktion mit Natriumborhydrid zu Aminogruppen und der darauf folgenden Verknüpfung mit dem Fmoc-Rink Amid Linker. Durch die Abspaltung des Fmoc mit Piperidin und dessen Quantifizierung durch UV/Vis Spektroskopie wurde so die gesamte Aminogruppen Oberflächenbeladung erhalten. Die Oberflächenbeladung mit Azidgruppen wurde dann durch die Differenz aus gesamter Amin- und tatsächlicher Amin-Oberflächenbeladung berechnet. Auf diese Weise war es möglich die Oberflächenbeladung sowohl von Aminen, als auch von Aziden an nur einem einzigen Nanopartikelsystem zu bestimmen. SPIONs können als Kontrastmittel für T2-gewichtete MRT Messungen verwendet werden. Jedoch werden sie auf Grund ihres Metabolismus nach der Injektion ins Blutsystem von Makrophagen, Leber, Milz und Niere aufgenommen. Um ein potentielles, gewebespezifisches SPION-basiertes Kontrastmittel für T2-gewichtete MRT Messungen zu erzeugen wurde das Neurohormonpeptid ALST1 mit Hilfe der CuAAC an die Azid-/Amin-funktionalisierten Silica-ummantelten SPIONs konjugiert, da von ALST1 eine Spezifität auf schwierig zu behandelnde neuroendokrine Tumore vermutet wird, auf Grund seiner Ähnlichkeit zu Galanin und Somastatin Rezeptorliganden. Der organische Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 5 (Cy5) wurde ebenfalls an den Azid-/Amin-funktionalisierten Silica-ummantelten SPIONs über einen NHS-Ester konjugiert um Zellaufnahmestudien mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie zu ermöglichen. Diese Materialien wurden mit TEM, dynamischer Lichtstreuung (DLS) und IR charakterisiert. Die Aminosäuren des konjugierten ALST1 wurden an Hand der bereits für Silica-Partikel beschriebenen HPLC-Methode bestimmt. Danach wurde die Relaxivität r2 bei 7 T gemessen. Leider sind der gemessene Wert von 27 L/mmolFe·s für das duale System ALST1-/Cy5-functionaliserte Silica-ummantelte SPIONs nicht mit klinisch verwendete T2 Kontrastmittel zu vergleichen, da diese bei einer Feldstärke von 1.5 T verwendet werden. Es ist jedoch anzunehmen, dass das synthetisierte Nanopartikelsystem bei 1.5 T eine geringere Relaxivität r2 zeigen würde als bei 7 T. Jedoch zeigen kommerzielle Kontrastmittel für T2-gewichtete MRT Messungen wie zum Beispiel VSOP-C184 von Ferropharm r2 Werte um die 30 L/mmolFe·s. Von daher hat das neue Material durchaus Potential als Kontrastmittel für T2-gewichtete MRT Messungen. Danach wurde das Material auf seine Zellaufnahme mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung des konjugierten Cy5 als Sonde untersucht. Die dualen ALST1-/Cy5-functionaliserte Silica-ummantelte SPIONs wurden mit MDA-MB 231 Zellen inkubiert, zeigten jedoch einen hohen Grad an Agglomeration, wobei große Konstrukte gebildet wurden die nicht mehr durch die zellularen Endozytosewege internalisiert werden konnten. Für weitere Anwendungen muss die Tendenz der Partikel zur Agglomeration verringert werden. Dies kann durch einen Wechsel der Hülle von Silica zu Polyethylenglykol (PEG) oder Chitosan erreicht werden, welche dafür bekannt sind Agglomeration zu verhindern als auch biologisch kompatibel, abbaubar zu sein. Im dritten Teil der Arbeit wurde die Rheniumverbindung [ReBr(CO)3(L)] mit L = 2-Phenyl-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin und ihr Mangan-Analogon synthetisiert durch Erhitzen des Liganden und Bromopentacarbonylrhenium, beziehungsweise Bromopentacarbonyl-mangan, in Toluol. Der Komplex [MnBr(CO)3(L)] wurde jedoch wegen seiner Instabilität bei Belichtung mit UV-Licht der Wellenlänge 365 nm für weitere Anwendungen verworfen. Die photophysikalischen Eigenschaften von [ReBr(CO)3(L)] wurden untersucht durch die Bestimmung der Lebenszeit des angeregten Zustandes mit der time-correlated single-photon counting (TCSPC) Methode und die Quantenausbeute mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrometers welches mit einer Integrationsphäre ausgerüstet war. Ein Wert von = 455 ns, einem Stokes shift von 197 nm und eine eher niedrige Quantenausbeute = 0.05 wurden ermittelt. Es wird behauptet, dass Metallkomplexe den organischen Fluoreszenzfarbstoffen überlegende Stokes shifts, Lebenszeiten des angeregten Zustandes sowie Quantenausbeuten haben. Aus diesem Grund wurde der Amino- und Azid-funktionalisierte DND mit ALST1, auf Grund seiner Eigenschaft die Zellaufnahme zu verstärken, funktionalisiert. Des Weiteren wurde eine Fluoreszenzsonde für Zellaufnahmestudien unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und die Partikeloberfläche konjugiert, welche entweder auf [ReBr(CO)3(L)] oder Cy5 basierten. Die Aldehyd-funktionalisierte Rheniumverbindung wurde über die Oxime Ligation an den Nanopartikel konjugiert, welche als milde und Katalysator-freie Konjugationsmethode bekannt ist. Die Menge des Peptids ALST1 auf der DND Oberfläche wurde durch HPLC nach saurer Hydrolyse und Derivatisierung mit PITC wie zuvor beschrieben analysiert und quantifiziert. Danach wurden die dualen ALST1-/Lumineszenzsonde-funktionalisierten DND in Bezug auf ihre photophysikalischen Eigenschaften mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Das Cy5-funktionaliserte Material zeigte in wässrigem Medium etwas geringere Lebenszeit des angeregten Zustandes mit < 0.4 ns als in der Literatur beschrieben und eine nicht bestimmbare Quantenausbeute durch die Integrationssphäre auf Grund der schwachen Emissionsintensität. Das [ReBr(CO)3(L)]-funktionalisierte Material zeigte eine sehr geringe Emissionsintensität in wässrigen Medium, welche es unmöglich machte die Lebenszeit des angeregten Zustandes und die Quantenausbeute zu bestimmen. Es war nicht möglich das Rhenium Komplex-funktionalisierte Material auf Grund seiner geringen Emissionsintensität in der Fluoreszenzmikroskopie nach Inkubation mit MDA-MB 231 Zellen zu visualisieren. Nach der Inkubation des Cy5-functionalisierten DND mit MDA-MB 231 Zellen, konnte das Material sehr gut auf Grund seiner roten Fluoreszenz identifiziert werden. Jedoch zeigte es keine Internalisierung in die Zellen nach Konjugation mit ALST1. Es wird vermutet dass die Peptidkette flach auf die Nanodiamantoberfläche, welche für ihre starke, nicht-kovalente Interaktion mit Proteinen und Peptiden bekannt ist, adsorbiert ist. Für zukünftige Anwendungen muss die ALST1-vermittelte Zellaufnahme der Detonationsnanodiamanten verbessert werden. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung anderer Linker-Systeme zur Verbrückung von Peptid und Partikeloberfläche um Adsorption zu verhindern. Die neuen analytischen Methoden für Amino-, Azid-, und Peptid-funktionalisierte Nanopartikel haben großes Potential in der Quantifizierung von Oberflächenmodifikationen von Nanopartikeln durch HPLC und UV/Vis. Die Bestimmung von Oberflächenbeladungen von Amin- und Azidgruppen basierend auf der Abspaltung von konjugiertem Fmoc des Fmoc-Rink Amid Linkers und Detektion durch UV/Vis Spektroskopie ist anwendbar auf alle Amin- und Azid-funktionalisierten Nanomaterialien. Jedoch kann es bei Partikeln welche besonders stabilen Suspensionen mit der Abspaltlösung bilden zu Problemen in der Quantifikation von Dibenzofulven und seinem Piperidin Addukt mittels UV/Vis Spektroskopie auf Grund von Streuung kommen. Die Detektion von Tyrosin- und Histidin-enthaltenden Peptiden auf Nanopartikeloberflächen auf Grundlage der Pauly Reaktion ist besonders geeignet als schneller und einfach durchzuführender qualitativer Nachweis für die erfolgreiche Konjugation von Peptiden auf Nanopartikeloberflächen. Der Hauptnachteil ist jedoch, dass Partikel mit Eigenfarbe nicht verwendet werden können. Die Aminosäureanalyse auf Grundlage von HPLC nach saurer Hydrolyse von Peptid-funktionalisierten Nanomaterialien und anschließender Derivatisierung mit PITC kann für alle Peptid- oder Protein-modifizierten Nanomaterialien verwendet werden. Es ermöglicht die Detektion von bis zu pikomolaren Konzentrationen und damit die Quantifizierung sehr geringe Oberflächenbeladungen mit Peptiden und Proteinen. Jedoch sind die resultierenden HPLC Chromatogramme schwierig zu interpretieren. Drei neue analytische Methoden auf der Grundlage von UV/Vis und HPLC Techniken wurden entwickelt und etabliert. Sie halfen bei der erfolgreichen Charakterisierung der synthetisierten DND und SPIONs mit dualer Funktionalisierung durch ALST1 und Cy5, beziehungsweise [ReBr(CO)3(L)]. Jedoch zeigten die Nanomaterialien auf Grund der hohen Tendenz zur Agglomeration keine Zellaufnahme. Das weitere Vorgehen umfasst die Verbesserung der Zellaufnahme durch ersetzen der Silica-Hülle der SPIONs mit PEG oder Chitosan. Bei den DND müssen andere Linkersysteme in Betracht gezogen und dann synthetisiert werden, welche d

Solar-Driven Degradation of Ciprofloxacin in the Aquatic Environment

Ciprofloxacin (CIP), a pharmaceutical compound, -occurs as a micropollutant in various types of environmental matrices including wastewater, because it is resistant to removal via conventional methods - due to its persistent characteristics. For this reason, in this work the efficiency of photodegradation CIP (2 mg L-1) in distilled water (DW) and tap water (TP) was investigated using TiO2 and ZnO at a concentration of 20 mg L-1 each. The tests were performed without and in the presence of SO42- ions (250 mg L-1) as one of main components of the aquatic, environmental matrices. Solar-driven photocatalysis using TiO2-P25 and ZnO improved the removal efficiency of CIP compared to its solar photolysis. In all cases approximately 90% removal of CIP was observed after 20 to 30 minutes, but no mineralization processes was achieved. The most efficient degradation was obtained using TiO2 at concentration of 20 mg L-1 in DW without the presence of SO42- after 5 minutes. The photodegradation rate constants estimated kt = 0.644 min-1 and kQUV = 0.249 L kJ-1. The complexity of the matrix affected the efficiency of CIP removal, favouring DW. The impact of sulfate anions also depended on the matrix: in distilled water, their impact was negative on the photocatalysis process efficiency, while in tap water, they slightly accelerated a process of CIP decomposition. Taking this into account, photocatalysis is an efficient; however, further research is necessary

Effect of LED light irradiation on morphology, chlorophyll content and photosynthetic activity of strawberry (Fragaria × ananassa DUCH.) cuttings

Manipulating the light characteristics with LEDs (light-emitting diodes) allows the regulation of various aspects of plant growth and development. The aim of the study was to investigate the effect of supplementary irradiation with LEDs emitting blue, red or far-red light on the growth, chlorophyll content, and photosynthetic activity of in vitro-derived plants of two strawberry cultivars with different photoperiod requirements, short-day cultivar ‘Elsanta’ and photoneutral cultivar ‘Selva’. Supplementary irradiation with blue light significantly affected the growth parameters of plants of the photoneutral strawberry ‘Selva’, but had no effect on the growth of ‘Elsanta’ plants. Exposure to blue light did not affect the chlorophyll content index (CCI) or the maximum efficiency of the photochemical reaction of photosystem II (Fv/Fm) of any strawberry cultivars. Red and far-red light supplementary irradiation did not significantly affect plant growth, but it improved the Fv/Fm parameter in both strawberry cultivars after 57 days of the experiment. Irradiation with red and far-red light inhibited the formation of runners, while blue light limited their development by 50%

Effect of LEDs lampson strawberry growth and development during ex vitro acclimatization

W doświadczeniu oceniano wpływ doświetlania lampami LED na rozwój mikrosadzonek truskawki podczas aklimatyzacji. Nieukorzenione mikrosadzonki odmiany „Pink Rosa” z laboratorium in vitro, oczyszczone z agaru. posadzono do multiplatów, do podłoża składającego się z wełny mineralnej chłonącej i niechłonacej (1:1). Rośliny uprawiano w kamerach wzrostowych zapewniając im wysoką wilgotność (80-90%), temperaturę 20-22°C oraz doświetlając je 16 godzin na dobę. Źródłem światła były: lampa sodowa 400 W (HPS), lampa LED – DAPLON-plus/2011 skonstruowana w Instytucie Elektrotechniki, emitująca światło w zakresach widmowych: czerwonym 68,5%, niebieskim 28,4% i bliskiej podczerwieni 3,1% (LED I) oraz lampa LED GrowBox emitująca światło czerwone i niebieskie 8:1 (LED II). Ze względu na wrażliwość mikrosadzonek początkowo rośliny cieniowano tak by natężenie napromienienia wynosiło 50 µmol m-2s-1, natomiast po 3 tygodniach zwiększono je do poziomu 100-120 µmol m-2s-1. Wszystkie rośliny nawożono identycznie płynną pożywką nawozową zawierającą makro i mikroskładniki. Wzrost i rozwój mikrosadzonek oceniono po 7 tygodniach aklimatyzacji. Zastosowane do doświetlania lampy LED wpłynęły bardzo korzystnie na wzrost mikrosadzonek truskawki. Mikrosadzonki doświetlanie lampami DAPLON-plus/2011 (LED I) miały największą świeżą masę, powierzchnię liści oraz najdłuższe korzenie. Nieznacznie słabiej rozwiniętą część nadziemną miały rośliny doświetlane drugim wariantem lamp, LED II. Rośliny doświetlane lampami LED wytworzyły więcej korzeni oraz miały grubsze szyjki korzeniowe niż doświetlanie lampami HPS.The effect of artificial lighting, using HPS and LED lamps during acclimatization of strawberry was evaluated. Unrooted strawberry plantlets ‘Pink Rosa’ obtained from in vitro laboratory were planted into growing media consisted of mineral wool granulates, water repellent and water absorbent (50:50 v/v). Plantlets were grown in growth chambers, with high humidity (80-90%), temp. 20-22°C and with artificial lighting using HPS (400 W) and LED lamps, photoperiod 16/8 h (day/night). Two types of LED lamps were used: LED I (Daplon-plus/2011 - emitted, red, blue and far red diodes at ratios 68,5%, 28,4% and 3,1%, respectively) and LED II (LED GrowBox – emitted red and blue light at ratios 8:1). Quantum irradiance was maintained at the same level in all treatments: 50 µmol m -2 s-1 during the first 3 weeks and later on 100-120 µmol m -2 s-1. All plants were fertigated twice a week using the same nutrient solution, contained macro and microelements. Plants were evaluated after 7 weeks of acclimatization. Both LED lamps used in this experiment resulted in greater weight, higher leaf area and better root development comparing to plantlets grown with HPS lamps

Carbohydrate content in the roots of strawberry tray plants as affected by the duration of cultivation and storage and its influence on fruit field

Changes in the levels of starch, sucrose and fructose in the roots of strawberry tray plants (cv. ‘Elsanta’) as affected by the duration of the gro wing period (8, 12, 18 or 20 weeks) were examined. Measurements of air temperature during the growing period were used to calculate cumulative chilling hours (<7 ̊ C). The largest accumulation of starch in the roots was found in the plants grown for 20 weeks , which was associated with the increased amount of chilling received by this group of plants (707 h). The lowest amount of starch was recorded in the roots of tray plants cultivated for 8 weeks (this group of plants had not been exposed to chilling temper atures at all). After storage ( - 1.5 to - 2 ̊ C in a cooling chamber) no starch and low concentrations of soluble carbohydrates (sucrose and fructose) were detected in the roots of the plants which had not been exposed to chilling (cultivated for 8 weeks). Als o, post - storage vigour and productivity were the lowest in this group of plants. There were no differences in fruit yield between the plants cultivated for 12, 18 or 20 weeks

Nuclear DNA content and ploidy level of apple cultivars including Polish ones in relation to some morphological traits

Apple species and cultivars differ in nuclear (2C) DNA content and ploidy level. The majority of these genotypes are diploids, but there are some triploids and a few tetraploids. Nuclear DNA content is a specific feature and its flow cytometric evaluation can be helpful in differentiating taxa. For many apple genotypes – including all the Polish ones, these characteristics are not known. 2C DNA was evaluated in relation to leaf, flower, fruit, pollen grain and stomata sizes as well as to the flowering time for seventy genotypes (including 46 Polish cultivars) gathered in the gene bank of the Research Institute of Horticulture, Skierniewice, Poland. For standard cultivars with the known chromosome number, 2C value was 1.71 pg for diploid cultivar ‘Alwa’ (2n=2x=34), 2.55 pg for triploid ‘Boskoop’ (3x=51), and 3.37 pg for tetraploid genome (4x=68) of mixoploid ‘McIntosh 2x+4x’. In 61 cultivars (including 41 Polish ones), the nuclear DNA content ranged from 1.58 to 1.78 pg indicating their diploid chromosome number. Five cultivars were identified as triploids (‘Bursztówka Polska’, ‘Pagacz’, ‘Rapa Zielona’, ‘Rarytas Śląski’ and ‘Witos’) owing to their nuclear DNA amount ranging between 2.42 and 2.58 pg. Leaf, flower, fruit, stomata and pollen grain sizes were on average significantly larger in triploids. Thus, in 3x plants the mean leaf surface was 49.1 cm², flower diameter – 52.4 mm, fruit weight – 204.7 g, stomata length – 32.1 μm and pollen grain diameter – 33.7 μm, whereas in diploids – 36.0 cm², 46.1 mm, 162.7 g, 28.4 μm and 30.7 μm, respectively. Pollen grain viability was on average significantly higher in diploids (75.6%), compared to triploids (22%). These results confirm that in apple, as in many other plant species, the higher ploidy level of triploids is generally associated with increased sizes of pollen grains, stomata, flowers, fruits and leaves but decreased pollen viability. No clear correlation between ploidy level and flowering time was found. In the case of mixoploid apple genotypes possessing diploid and tetraploid genomes, some phenotype observation is helpful in describing the ploidy level of the histogenic layers, L1 and L2. Small stomata sizes (similar to diploid) indicate diploid L1 and larger leaf sizes, compared to diploid counterparts, show tetraploid L2. The results will be used for breeding, in which it is important to determine maternal and paternal genotypes as well as the direction of the crossing that is of great importance in obtaining seeds and materials for further selection